污泥调理对氨基糖苷类耐药菌的削减作用研究

2021-03-17孟晓青王电站郑冠宇周立祥南京农业大学资源与环境科学学院江苏南京210095

中国环境科学 2021年2期

陈宇,姜爽,孟晓青,王电站,郑冠宇,周立祥 (南京农业大学资源与环境科学学院,江苏南京 210095)

抗生素的不合理使用甚至滥用导致耐药菌(ARB)和耐药基因(ARGs)在全球范围内的广泛传播,严重威胁人类健康和生态安全.城市污水处理厂是ARB 和ARGs 重要的储存库和传播地[1-2]:一方面,残留于污水中的抗生素可以诱导ARB 的产生和富集;另一方面,ARGs 可通过基因水平转移在微生物间进一步扩散传播,甚至使部分微生物获得多重抗性.传统的生化处理过程将城市污水中大量的ARB和ARGs 转移汇集到城市污泥中,而污泥的处理处置过程可能会导致抗生素抗性在环境中的进一步扩散和传播[3].

作为污泥处理处置过程中的重要步骤,污泥机械脱水不仅可减少污泥体积,而且有利于脱水污泥的填埋、焚烧、堆肥等后续处理[4].然而,剩余活性污泥的胶体特性导致其直接机械脱水非常困难,因此在机械脱水前必需对污泥进行调理从而改善其脱水性能[5-6].已有研究表明,污泥调理不但能够有效改善脱水性能,而且部分调理方式能够有效削减污泥中的ARGs.如生物沥浸调理和Fe[III]/CaO调理可以有效削减污泥中的大部分种类的ARGs[7],且其效率远高于污泥厌氧消化处理[8-9].另外,也有研究发现污泥调理对污泥中的病原微生物也有一定的杀灭作用[10-11].Qi 等[12]研究发现脱水消化污泥37℃放置24h 后其中的粪大肠菌群数量有所增长,因为VBNC(存活但不可培养)状态的微生物在污泥储存过程中恢复生长活性.然而,尽管ARB 的耐药性正是ARGs 危害性的一种体现[13],但对于污泥调理处理如何影响污泥中的ARB 仍缺乏进一步的研究.同时,在实际工程应用中,污泥脱水后往往会放置一段时间后才进行后续的处理处置,关注污泥储存放置过程中ARB 含量的变化也可更好评估其环境风险.

氨基糖苷类抗生素主要通过抑制蛋白质合成作用于革兰氏阴性菌,其化学性质稳定、抗菌谱广,在人类和畜禽疾病治疗中应用广泛[14].有研究报道,氨基糖苷类ARGs 是污泥中含量较高的ARGs 种类[8-9].Zheng 等[7]发现剩余污泥中氨基糖苷类ARGs的绝对丰度达到ARGs 总绝对丰度的75%,说明其是污泥中丰度最高的ARGs 种类.本研究分别采用聚丙烯酰胺(PAM)调理、Fe[III]/CaO 调理、化学酸化调理以及生物沥浸调理四种方式处理剩余活性污泥,采用异养菌培养法比较了以上4 种污泥调理方法对脱水泥饼和脱水滤液中链霉素、庆大霉素、卡那霉素3 种典型氨基糖苷类ARB 的削减效果,结合调理污泥中微生物细胞裂解和污泥微生物胞外聚合物(EPS)变化情况探究污泥调理削减脱水泥饼和脱水滤液中ARB 的主要原因,并进一步研究脱水泥饼自然放置过程中氨基糖苷类ARB 数量变化从而阐明其环境风险.

1 材料与方法

1.1 污泥样品

剩余活性污泥取自江苏省无锡市太湖新城污水处理厂污泥浓缩池,污泥基本理化性质如表1 所示.供试污泥装于无菌塑料瓶中,冷藏运回实验室后置于4℃冰箱中,并在取样24h 内对污泥进行调理.

1.2 污泥调理

分别采用PAM 调理法、Fe[III]/CaO 调理法、化学酸化调理法、生物沥浸调理法来处理污泥.PAM调理主要利用有机絮凝剂聚丙烯酰胺中和污泥颗粒所带的负电荷,减小污泥颗粒和水分子之间的亲和力,降低污泥颗粒间的排斥力并促使污泥絮凝,改善污泥脱水性能[15];Fe[III]/CaO 调理主要是通过氯化铁电离作用生成的带电离子与污泥中的胶粒发生电中和,破坏胶体体系的稳定性并促进污泥颗粒团聚下沉从而提高脱水速率,同时氧化钙能够作为骨架构建物改善污泥的机械强度和渗透性能[16];化学酸化调理可以改变污泥表面性质,并分解有机质、破坏微生物细胞,释放细胞间隙水和胞内水从而改善污泥脱水性能;生物沥浸调理法是利用嗜酸性硫杆菌的生物氧化和生物酸化作用实现污泥中微生物胞溶及微生物胞外聚合物降解,从而大幅改善污泥的脱水性能[7].具体调理步骤如下.

PAM 调理:制备浓度为2000mg/L 的PAM 储备液,放置24h 待其基团充分伸展[16].取250mL 污泥置于500mL 三角瓶中,使用磁力搅拌器在270r/min 转速下振荡的同时向其中以2.3mg/g DS(dry solids,污泥干重)的剂量加入12.08mL 的PAM 储备液,在270r/min 转速下振荡1min,然后在30r/min 的转速下继续振荡9min,完成处理[15].

Fe[III]/CaO 调理:取250mL 污泥置于500mL 三角瓶中,以0.3g CaO/g DS 的剂量向其中加入3.16g CaO,将三角瓶置于28℃恒温摇床中以180r/min 转速振荡30min.随后以0.08g Fe[III]/g DS 的剂量向污泥中加入1.39g FeCl3·6H2O,继续在28℃及180r/min转速的恒温摇床中振荡30min,完成处理[16].

生物沥浸调理:取225mL 污泥置于500mL 三角瓶中, 并向其中接种 25mL Acidithiobacillus ferrooxidans LX5 菌液,以10g/L 的剂量添加2.5g FeSO4·7H2O[17-19].随后将三角瓶置于28℃恒温摇床中以180r/min 的转速培养约40h,直到污泥的pH 值约为2.5,此时处理完成.

化学酸化调理:取250mL 污泥置于500mL 三角瓶中,向其中加入9.20mol/L 的H2SO4将污泥pH值调节至 2.5 左右,并在 28℃恒温摇床中以180r/min 的转速振荡30min.由于污泥有较强的缓冲性,所以需要反复操作添加H2SO4多次直到污泥pH 值稳定[5].

调理后污泥的基本性质理化性质如表1 所示,采用流式细胞仪测定调理污泥中微生物细胞裂解情况,提取调理污泥中EPS 并分别测定黏液层胞外聚合物(Slime-EPS)、松散结合的胞外聚合物(LBEPS)及紧密结合的胞外聚合物(TB-EPS)含量.然后,使用实验室过滤压缩装置对调理后的污泥样品进行机械脱水处理[5].该过滤压缩脱水装置由一个过滤压缩元件和一个配备稳压减压阀的空压机组成,其中过滤压缩元件是高为162mm、内径为50mm内置活塞的不锈钢圆柱体,底部是孔径为1mm 的不锈钢板.空压机向元件内部提供稳定压力(0.5MPa)的气体,气体推动活塞挤压污泥完成脱水.分别收集脱水泥饼和脱水滤液,测定脱水泥饼和脱水滤液中链霉素、庆大霉素、卡那霉素3 种典型氨基糖苷类耐药菌的含量,并检测污泥脱水滤液中的悬浮固体含量.

对原始污泥以及各调理污泥进行脱水处理后,使用培养皿收集泥饼,置于28℃恒温培养箱中.在第0(脱水后当日)、4、8、12、16 和20d 进行取样.每份泥饼样品中,取3 块不同位置的泥饼进行混合,以减小误差.将所取各样品分别与9mL 0.85%无菌NaCl 溶液混合,充分涡旋混匀后进行梯度稀释[20].随后使用异养菌平板计数法来测定其中氨基糖苷类ARB 的数量,以考察脱水泥饼自然放置过程中氨基糖苷类ARB 数量的变化.

表1 原始污泥和调理污泥基本理化性质Table 1 Primary physicochemical properties of raw sludge and conditioned sludge

1.3 测定方法

1.3.1 脱水泥饼和脱水滤液中氨基糖苷类ARB 含量的测定采用异养菌平板计数法测定不同调理方式处理后的脱水泥饼以及脱水滤液中氨基糖苷类ARB 的数量[20].对于脱水污泥,将1g 脱水泥饼与9mL 0.85%无菌NaCl 溶液混合,充分涡旋混匀后进行梯度稀释;对于污泥滤液,先将100mL 污泥滤液过0.22μm 无菌滤膜,然后将滤膜置于50mL 无菌磷酸盐缓冲液中并涡旋混匀后进行梯度稀释[3].选择合适的稀释梯度涂布于高压灭菌后的R2A 培养基平板(solaribio, China)上,培养基中加入100mg/L 的放线菌酮(solaribio, China),且分别加入如下抗生素:100mg/L 链霉素(solaribio, China),用以统计链霉素ARB 的数量;20mg/L 庆大霉素(solaribio, China),用以统计庆大霉素ARB 的数量;100mg/L 卡那霉素(solaribio, China),用以统计卡那霉素ARB 的数量.同时设置只添加100mg/L的放线菌酮以抑制真菌生长的对照平板,用来测定样品中总异养细菌含量.所有平板置于30℃恒温培养箱中培养5d,随后统计形成的菌落数.

1.3.2 调理污泥中微生物细胞裂解情况测定对调理污泥样品进行荧光染色,然后利用流式细胞仪(FCM)分析污泥中微生物细胞的细胞膜破坏情况[21].采用无菌水将调理后污泥稀释至含固率约为0.005%,取0.5mL 稀释后样品,使用细胞凋亡试剂盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Sigma Aldrich, USA)对其进行染色.分别使用10μL PI 染料以及5μL V-FITC 染料对污泥微生物细胞染色.染色后的样品于室温下静置避光培养15min,然后使用流式细胞仪BD Biosciences AccuriC6flow cytometer(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Calif.)进行分析,488nm激光由50mW蓝色固态激光器发出.设置滤光片,于520nm 处检测绿色荧光(FL1),于630nm 处检测红色荧光(FL3).所有分析在细胞染色后的1h 之内完成,测定过程中对每个样品采集的细胞数约为10000 个[22].

1.3.3 调理污泥中污泥EPS 的提取与测定分别提取调理污泥的Slime-EPS、LB-EPS 以及TB-EPS三层EPS[23].将各调理后的污泥在2500g 的条件下离心15min,收集上清液获得Slime-EPS;用pH 值为7.0 的缓冲液将沉积物重悬至原体积,然后在5000g的条件下离心15min,收集上清液获得LB-EPS;沉积物重新悬浮后,在恒温水浴锅中 60℃水浴加热30min,最后在15000g 的条件下离心5min 获得TB-EPS.使用0.45μm 过滤颗粒物后,获得的上述EPS 溶液用TOC 分析仪进行测定[24].

1.4 数据分析

采用SPSS 24.0 软件进行显著性检验和相关性分析.

2 结果与讨论

2.1 污泥调理方式对脱水泥饼和脱水滤液中氨基糖苷类ARB 含量的影响

本实验选用的4 种调理方式处理均能改善污泥脱水性能.化学酸化调理虽使污泥比阻升至18.61×1012m/kg,但将脱水泥饼含水率降至65.59%.而生物沥浸调理、PAM 调理和Fe[III]/CaO 调理污泥后,污泥比阻分别降为 0.15×1012m/kg、0.39×1012m/kg 和0.11×1012m/kg,而脱水泥饼含水率则分别降至65.60%、81.42%和69.00%.城市污水处理厂通常会将污泥机械脱水产生的脱水泥饼经堆肥、焚烧或填埋等方式进行处置,而将脱水滤液与污水处理厂进水进行混合后处理,因此有必要研究不同污泥调理方式对脱水泥饼和脱水滤液中ARB 含量的影响.如图1 所示,化学酸化调理、生物沥浸调理和Fe[III]/CaO 调理使脱水泥饼中总细菌的含量降低了0.71～0.82 个数量级,也不同程度削减了脱水泥饼中的庆大霉素、链霉素以及卡那霉素三类ARB 的含量.其中,Fe[III]/CaO 调理对脱水泥饼中氨基糖苷类ARB 削减作用最大,分别将链霉素、庆大霉素、卡那霉素ARB 的数量降低1.30、1.72 以及2.10 个数量级;生物沥浸调理将3 种氨基糖苷类ARB 降低了0.77 至1.54 个数量级;化学酸化则将3 种ARB 降低了0.83 至1.65 个数量级.然而,原始污泥经PAM 调理前后,脱水泥饼中总细菌含量和3 种氨基糖苷类ARB 的含量均无明显变化(P＜0.05),说明PAM 调理未能有效削减脱水泥饼中总细菌和3 种氨基糖苷类ARB.在污泥脱水滤液中,生物沥浸调理和Fe[III]/CaO 调理使得庆大霉素、链霉素以及卡那霉素三类ARB 均未能检出,同时分别使总细菌含量降低了3.76 和1.74 个数量级.然而,化学酸化调理和PAM 调理分别使脱水滤液中总细菌数量上升了0.61 和0.31 个数量级,化学酸化调理不仅未能有效削减脱水滤液中的3 种ARB 反而使其含量上升了0.26 至0.39 个数量级,而PAM 调理仅能将庆大霉素ARB 削减0.16 个数量级,对另两种ARB 无明显的削减作用.采用异养菌平板计数法测定不同调理方式处理后的脱水泥饼及脱水滤液中氨基糖苷类ARB的数量,选用的R2A 琼脂培养基是一种低营养培养基.事实上,污泥中可培养的细菌数量是相当有限的,大部分细菌处于存活但不可培养状态,且有部分细菌虽然携带ARGs 却不表达相应的抗性.因此,实际污泥中的氨基糖苷类ARB 可能远大于本实验统计的数量.

Tong 等[25]的研究表明,微波预处理结合厌氧消化可以将污泥中氨苄青霉素ARB 的含量削减0.56个数量级,程度远低于1 个数量级.而在本实验中,Fe[III]/CaO调理即可将脱水泥饼中3种氨基糖苷类ARB 削减1 个数量级以上,甚至可以将卡那霉素ARB 削减2.10 个数量级.综上所述,Fe[III]/CaO 调理以及生物沥浸调理可以大幅度削减脱水泥饼中氨基糖苷类ARB 的含量,并同时完全去除脱水滤液中的氨基糖苷类ARB;PAM 调理未能有效去除脱水泥饼以及脱水滤液中的氨基糖苷类ARB;化学酸化调理虽然也可有效削减脱水泥饼中氨基糖苷类ARB的含量,但会导致脱水滤液中的氨基糖苷类ARB 数量的上升.在以往的研究中,我们发现不同调理方法削减污泥ARGs 的效果也有所差异[7]:PAM 调理不能去除污泥中的ARGs,化学酸化调理可以有效削减污泥中大部分ARGs 的绝对丰度,但增加其相对丰度,而生物沥浸调理和Fe[III]/CaO 调理能够降低大多数ARGs 的相对丰度和绝对丰度.上述结果表明,生物沥浸调理和Fe[III]/CaO 调理可能是污水处理厂削减脱水泥饼和脱水滤液中ARB 的有效手段.

图1 不同调理方法处理后脱水泥饼和脱水滤液中链霉素ARB、庆大霉素ARB、卡那霉素ARB 及总细菌的对数浓度Fig.1 Logarithm concentration of streptomycin resistant bacteria, gentamicin resistant bacteria, kanamycin resistant bacteria and total heterotrophic bacteria in dewatered sludge cake and dewatering sludge filtrate after sludge conditioning treatments

2.2 污泥调理影响脱水泥饼和脱水滤液中氨基糖苷类ARB 的机制探究

为探究不同调理方式削减脱水泥饼和脱水滤液中ARB 效果差异的原因,利用流式细胞仪对调理前后污泥中微生物细胞裂解情况进行分析.如图2所示,在原始污泥中,完整的细胞和膜损伤细胞分别占比90.6%和9.18%.在化学酸化调理、生物沥浸调理以及Fe[III]/CaO 调理后的污泥中,膜损伤细胞的比例上升至61.4%、58.6%以及55.0%,但PAM 调理仅仅将污泥中膜损伤细胞比例升高至12.0%.因此,化学酸化调理、生物沥浸调理以及Fe[III]/CaO 调理能够高效破坏污泥中微生物细胞的细胞膜,从而导致污泥中微生物细胞裂解,而PAM 调理对于污泥中微生物细胞的破坏用作极其有限.Zhou 等[26]的研究表明化学酸化调理和生物沥浸调理会严重破坏污泥中微生物的细胞膜释放出胞内物质,进而改变污泥固相和液相中的有机质含量.作者先前的研究也发现污泥调理会严重破坏微生物细胞膜引起细胞裂解,从而有效削减污泥中ARGs 的丰度[7].

图2 不同调理污泥中完整细胞和破损细胞的数量Fig.2 Counts of intact cells and damaged cells in sludge treated by different conditioning approaches

对脱水泥饼及脱水滤液中氨基糖苷类ARB 的数量和调理污泥中微生物细胞裂解程度进行相关性分析(表2).结果表明,脱水泥饼中3 种氨基糖苷类ARB 的含量与污泥中完整细胞数量呈显著正相关(P＜0.01),而与膜损伤细胞数量呈显著负相关(P＜0.01).也即,调理污泥中被破坏的微生物细胞越多,氨基糖苷类ARB 的数量越少,而完整的微生物细胞越多,氨基糖苷类ARB 的数量也越多.因此,污泥调理过程中微生物细胞的裂解导致脱水泥饼中ARB 的削减.但是,脱水滤液中氨基糖苷类ARB 的含量与调理污泥中完整细胞和膜损伤细胞数量并无显著性关系(P＞0.05),表明脱水滤液中的ARB 的削减除受微生物细胞裂解影响外还可能受其他因素影响[24].

针对化学酸化调理导致污泥脱水滤液中氨基糖苷类ARB的数量增长的原因(图1b),进一步比较了不同调理污泥中污泥EPS 的含量及脱水滤液中悬浮固体的浓度.结果表明,化学酸化调理污泥中Slime-EPS含量和脱水滤液中悬浮固体的浓度最高(图3、图4).而化学酸化导致污泥释放大量的Slime-EPS 和悬浮固体到污泥滤液中,这部分EPS 和悬浮固体可能裹挟ARB 从污泥固相转移到污泥液相中[25],进而导致脱水滤液中氨基糖苷类ARB 的增多.与化学酸化调理不同,生物沥浸调理以及Fe[III]/CaO 调理在破坏微生物细胞的同时,可有效絮凝悬浮固体,阻止污泥Slime-EPS 释放[15],所以能够实现脱水泥饼及脱水滤液中氨基糖苷类ARB 的同步去除.

表2 脱水泥饼和脱水滤液中氨基糖苷类ARB 的数量与污泥微生物细胞破坏程度之间的皮尔逊相关性分析Table 2 Pearson’s correlation analysis between the concentration of aminoglycoside resistant bacteria in dewatered sludge cake or dewatering sludge filtrate and the membrane damage of sludge microbial cell

图3 不同调理方法处理后污泥中Slime-EPS、LB-EPS 和TB-EPS 含量Fig.3 Contents of slime-EPS, LB-EPS and TB-EPS in sludge treated by different conditioning approaches

图4 不同调理污泥脱水滤液中悬浮固体浓度Fig.4 Suspend solid content in dewatering sludge filtrate of various conditioned sludge samples

2.3 脱水污泥自然放置过程中氨基糖苷类ARB 含量的变化

如图5 所示,经不同调理方式处理获得的脱水泥饼在污泥放置的0～4d,总细菌含量均有轻微的降低,其中未调理污泥(原始污泥)的脱水泥饼中总细菌数量仅降低了0.15 个数量级,而化学酸化调理获得的脱水泥饼中总细菌数量也仅降低了0.57 个数量级.在脱水泥饼自然放置的4～8d,所有处理中的总细菌含量均明显上升,尤其是Fe[III]/CaO 调理、生物沥浸调理及化学酸化调理样品中总细菌含量上升幅度较大(1.49～2.14 个数量级),而未调理污泥和PAM 调理污泥的脱水泥饼中总细菌含量上升了0.52～0.67 个数量级.随着放置时间的延长,各脱水污泥样品中的总细菌含量小幅波动.

图5 脱水泥饼自然放置过程中链霉素ARB、庆大霉素ARB、卡那霉素ARB 及总细菌的对数浓度随放置时间的变化Fig.5 Changes in logarithm concentrations of streptomycin resistant bacteria, gentamicin resistant bacteria, kanamycin resistant bacteria and total heterotrophic bacteria with the extension of incubation period during the natural storage of dewatered sludge cakes

未调理污泥(原始污泥)和PAM 调理的脱水泥饼在自然放置过程中3 种氨基糖苷类ARB 含量的变化幅度小于1.57 个数量级,且存在缓慢降低的趋势.然而,Fe[III]/CaO 调理、生物沥浸调理以及化学酸化调理获得的脱水泥饼在自然放置培养的8～16d中,3 种ARB 的含量均明显上升.化学酸化调理样品中3 种ARB 含量的上升幅度最大,与培养前相比,链霉素、庆大霉素和卡那霉素ARB 分别增加了2.52、2.09 以及2.70 个数量级.生物沥浸调理样品中链霉素、庆大霉素和卡那霉素3 种ARB 含量上升幅度较小,但也分别达到0.72、1.20 以及1.10 个数量级.虽然16～20d 自然放置期内,Fe[III]/CaO 调理、生物沥浸调理以及化学酸化调理的脱水泥饼中链霉素ARB 的数量有小幅的下降,但在20d 自然放置结束时,其氨基糖苷类ARB 的含量均远高于原始污泥以及PAM 调理污泥.

许多学者对于细菌的VBNC 状态进行了研究[27-28],发现细菌在外界给予压力的情况下(营养缺乏、温度变化、紫外辐射、极端pH 等)会进入VBNC状态.而当外界压力消失后,VBNC 状态的细胞会逐渐复苏[28-30].一方面,污泥在经过调理后,脱水泥饼中的部分ARB 可能进入VBNC 状态,虽然存活,但是不能通过平板培养的方法检测.而在后续放置过程中,VBNC 状态的ARB 在适宜的条件下复苏,并随着放置时间的延长大量繁殖生长.另一方面,脱水泥饼中残余的部分氨基糖苷类ARGs 在自然放置过程中可能通过水平转移的方式在污泥中传播扩散,使得原本不具备抗性的细菌获得抗性.

综上所述,PAM 调理后的脱水泥饼在放置过程中氨基糖苷类ARB 的变化与未调理污泥的脱水泥饼类似,均呈现缓慢下降的趋势;而Fe[III]/CaO 调理、生物沥浸调理以及化学酸化调理获得的脱水泥饼中氨基糖苷类ARB 的含量在泥饼自然放置过程中大幅增加,且在放置20d 后3 种氨基糖苷类ARB的数量都远大原始污泥样品;ARB 在脱水泥饼自然放置过程中的快速繁殖也更利于污泥中ARGs 在细胞间的传播扩散,从而给脱水泥饼的后续处理处置带来一定的环境风险.因此,应该尽量缩短城市污水处理厂中脱水泥饼自然放置的时间,应在脱水泥饼的后续处理处置放置过程中密切关注ARB 含量的变化并采用适当的技术控制其环境风险.