长链非编码RNA TTN-AS1通过miR-3928调节p38MAPK参与宫颈癌进展的机制研究

刘晓娟，谢双双，张 晶，康燕华

河北北方学院附属第一医院妇产科，河北张家口 075002

尽管新的诊断技术和治疗方法不断被应用于临床，但是宫颈癌患者的预后仍然不令人满意。研究发现宫颈癌的转移和复发是引起宫颈癌患预后不佳的主要因素，p38MAPK由MAPK14基因编码，是引起宫颈癌进展、转移的重要蛋白[1]，但是其具体的调控机制尚不完全明确。最新研究证实了微小RNA(miRNA)与肿瘤发生和发展密切相关，miRNA可通过直接靶向靶基因的信使RNA(mRNA)诱导其讲解或转录抑制，从而转录后水平上调节基因的表达从而参与肿瘤的发展[2]。miR-3928是近年来新发现的与肿瘤相关的miRNA，有研究发现下调miR-3928的水平可以促进骨肉瘤的进展，提示miR-3928具有抑癌作用[3]，但是miR-3928在宫颈癌中的作用尚不清楚。此外，miRNA的靶向作用又被长链非编码RNA(LncRNA)的靶向调控，LncRNA会像“海绵”一样吸附miRNA从而调控靶基因的表达[4]。最新研究发现TTN-AS1可通过靶向miR-4677-3p促进ZEB1基因的表达，从而发挥促进肺腺癌细胞迁移和侵袭[5]。本研究主要分析RNA TTN-AS1通过miR-3928 调节p38MAPK参与宫颈癌进展的机制。

1 材料与方法

1.1材料 人宫颈癌细胞系CasKi(ATCC公司，美国)。DMEM培养基(Invitrogen公司，美国)。miR-3928类似物(mimic)、TTN-AS1和p38MAPK过表达质粒及相应的阴性对照(NC)(Thermo Fisher公司，美国)。Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)。双荧光素酶报告试剂盒和相应的荧光检测仪(Promega公司，美国)。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试剂盒(Beyotime生物技术研究所，中国)。凋亡检测试剂盒和FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciencesg公司，美国)。Transwell小室和基质凝胶(BD Biosciences公司，美国)。PCR引物由Genewiz公司(中国)设计和合成。Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)。逆转录cDNA试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR试剂盒(Roche公司，瑞士)。ABI 7500 PCR检测系统(Life technology公司，美国)。 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解缓冲液(Beyotime公司，中国)。二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒和电化学发光(ECL)试剂盒(北京Applygen公司，中国)。p38MAPK、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体和二抗(Abcam公司，美国)。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司，美国)。

1.2生物信息学分析 通过工具网站GEPIA分析肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库的宫颈癌患者TTN-AS1水平与宫颈癌进展情况和与MAPK14水平之间的关系。预测TTN-AS1靶向miR-3928和miR-3928靶向p38MAPK的结合位点。

1.3双荧光素酶报告实验 将细胞分为对照组和miR-3928模拟组(mimic组)，并分别通过质粒转染NC和miR-3928mimic。在验证miR-3928靶向p38MAPK时，分别将野生型的p38MAPK(p38MAPK-wt)或突变的p38MAPK(p38MAPK-mut)克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体中。然后分别通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)或蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测各组miR-3928和p38MAPK的水平。

在验证TTN-AS1时靶向miR-3928时，分别将TTN-AS1-wt和TTN-AS1-mut克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体中。将CasKi细胞接种在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000将克隆和突变的序列转染至细胞中。使用荧光素酶报告检测仪评估荧光素酶活性。

1.4qPCR检测TTN-AS1、miR-3928和p38MAPK mRNA 通过Trizol获得细胞中总RNA，然后验总RNA的纯度和浓度。使用cDNA试剂盒将1 μg RNA逆转录合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR实验(在95 ℃ 10 min，40个循环，94 ℃ 15 s，60 ℃/1 min，60 ℃ 1 min，4 ℃保存)。GAPDH作为mRNA和LncRNA的内参，U6作为miRNA的内参，通过比较循环阈值(ΔΔCt)用于分析RNA的表达。

1.5Westernblot检测p38MAPK蛋白的表达 在液氮下将细胞研磨，在液氮保护下使用RIPA裂解缓冲液裂解，并使用BCA蛋白测定试剂盒测量总蛋白含量。然后使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的总蛋白(120 V下电泳90 min)，然后转移到PVDF膜上(50 V,120 min)，在含有5%脱脂牛奶的封闭溶液中封闭。然后将PVDF膜与一抗(1∶1 000稀释)在4 ℃孵育过夜，然后加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗在室温下孵育1 h。使用ECL试剂盒可视化蛋白条带，并使用ImagePD软件使用GAPDH作为内参对蛋白条带的灰度进行定量。

1.6细胞培养、分组和转染 将CasKi细胞在DMEM培养基中培养，37 ℃。5% CO2，相对湿度100%。将细胞分为4组，即对照组、mimic组、mimic+TTN-AS1组和TTN-AS1组。使用Lipofectamine 2000试剂盒进行瞬时转染，其中mimic组和mimic+TTN-AS1组通过转染miR-3928 mimic质粒以过表达miR-3928，mimic+TTN-AS1组和TTN-AS1组转染p38MAPK质粒过表达p38MAPK。对照组转染两种NC质粒，在转染24 h后收集细胞进行后续试验。

1.7CCK-8检测细胞活力 将细胞接种于96孔板(每孔2×104个细胞，100 μL)，在培养第48 h加入10 μL CCK-8试剂并在37 ℃下培养，通过酶标仪检测450 nm处的吸光度计算相对细胞活力。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡率 将细胞消化后重悬，在2×105个细胞中分别加入异硫氰酸荧光素(FITC) Annexin V和7-氨基放线菌素D(7-AAD)各10 μL和5 μL，然后分别室温、避光下分别孵育15 min，然后通过进行流式细胞术，通过配套Cell Quest软件分析凋亡率。

1.9荷瘤裸鼠实验 在Transwell小室的上室加入基质胶，底室加入完全培养基，然后将2×104个细胞加入至上室培养48 h。48 h后洗去未侵入底室的细胞。然后将细胞使用20%甲醇固定，并用0.2%结晶紫染色。在倒置显微镜下计数每个视野侵入底部室的细胞数目。

2 结 果

2.1生物信息学分析结果 在TCGA数据库中，根据GEPIA的分析结果，发现高水平的TTN-AS1的宫颈癌患者具有更短的无进展生存期(P<0.05)，并且TTN-AS1的水平与MAPK14的转录水平呈正相关(r=0.320,P<0.05)。见图1。

注：A为GEPIA数据库中TTN-AS1表达与宫颈癌患者无进展生存期的相关性;B为GEPIA数据库中TTN-AS1表达与MAPK14表达的相关性；TPM为每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts；HR为生存资料的效应量，比较一段时间内的风险。

2.2TTN-AS1直接靶向miR-3928 TTN-AS1靶向miR-3928的结合位点见图2。然后通过双荧光霉素试验结果验证了同时转染NC+TTN-AS1-wt和NC+TTN-AS1-mut的细胞的荧光酶素活性分别为(1.00±0.09)、(1.04±0.12)，与miR-3928 mimic+TTN-AS1-mut比较(0.98±0.16)，miR-3928 mimic+TTN-AS1-wt细胞的荧光酶素活性显著降低(0.34±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05)，说明TTN-AS1直接靶向miR-3928。

2.3miR-3928靶向抑制p38MAPK的表达 miR-3928靶向p38MAPK的结合位点:MAPK14(位置6589-6595)的碱基序列5′……agccaacuggggagaGAGCUUCu……3′与miR-3928的碱基序列3′-cguccgccuuggaauCUCGAAG-5′具有结合位点。然后通过双荧光霉素实验结果验证了同时转染NC+p38MAPK-wt和NC+p38MAPK-mut的细胞的荧光酶素活性分别为(1.00±0.07)、(1.02±0.15)，与miR-3928 mimic+p38MAPK-mut比较(0.95±0.12)，miR-3928 mimic+p38MAPK-wt细胞的荧光酶素活性显著降低(0.350±0.045)，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步研究也发现，与对照组[分别为(3.36±0.31)、(2.83±0.34)]比较，转染miR-3928mimic后，细胞中p38MAPKmRNA和蛋白的水平降低[分别为(0.83±0.08)、(1.27±0.14)]，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 TTN-AS1直接靶向miR-3928的结合位点

2.4各组细胞中TTN-AS1、miR-3928、p38MAPK mRNA和蛋白的水平 mimic组miR-3928水平高于对照组，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TTN-AS1组miR-3928水平低于对照组，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。mimic+TTN-AS1组miR-3928水平低于mimic组，TTN-AS1、p38MAPK mRNA和蛋白水平高于mimic组，差异有统计学意义(P<0.05)。miR-3928对p38MAPK的抑制作用被TTN-AS1阻断，见表1。

表1 各组细胞中TTN-AS1、miR-3928、p38MAPK mRNA和蛋白的水平比较

2.5各组细胞的细胞生长和凋亡情况比较 mimic组的细胞活力显著低于对照组，凋亡率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，TTN-AS1组的细胞活力高于对照组，细胞凋亡率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，并且mimic+TTN-AS1组的细胞活力高于mimic组，细胞凋亡率低于mimic组，差异有统计学意义(P<0.05)。过表达TTN-AS1会阻断miR-3928对细胞生长的抑制作用和对凋亡的促进作用，见表2、图3。

表2 各组细胞的相对细胞活力和凋亡率比较

2.6各组细胞侵袭能力比较 mimic组的细胞侵袭能力[(20.37±2.08)个]低于对照组[(37.67±3.57)个]，差异有统计学意义(P<0.05)，TTN-AS1组的细胞侵袭能力[(57.86±3.98)个]高于对照组[(37.67±3.57)个]，差异有统计学意义(P<0.05)，并且mimic+TTN-AS1组的细胞侵袭能力[(39.40±3.14)个]高于mimic组[(20.37±2.08)个]，差异有统计学意义(P<0.05)。过表达TTN-AS1会部分逆转miR-3928对细胞侵袭的抑制作用，见图4。

注：A为对照组、B为mimic组、C为mimic+TTN-AS1组、D为TTN-AS1组。

注：A为对照组、B为mimic组、C为mimic+TTN-AS1组、D为TTN-AS1组。

3 讨 论

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，根据最近的统计报告，2018年宫颈癌新病例数为569 847例，占所有肿瘤的3.2%。并且2018年死于宫颈癌的患者共有311 365例，占所有恶性肿瘤的3.3%[6]。虽然许多早期诊断宫颈癌的新生物标志物被发现，并且靶向药物、免疫疗法等新的治疗手段被不断地应由于宫颈癌的治疗，但由于肿瘤的转移、复发和获得性耐药的发生，仍有一部分患者不能取得较好的预后[7]。探究宫颈癌转移的分子机制提高是发展新的诊断和治疗策略的基础。

抑癌基因和促癌基因的异常低表达和过表达是导致肿瘤发生和进展的主要机制，p38MAPK蛋白最初在炎症和应激反应中发现，后来被认为是一种与肿瘤相关的蛋白[8]。在宫颈癌中，p38MAPK发挥促癌作用，激活p38MAPK相关通路会促进肿瘤细胞迁移和侵袭，是宫颈癌转移的分子机制之一[9]。并且p38MAPK蛋白的表达会受到miRNA的靶向调节，miR-374b可通过抑制p38MAPK抑制宫颈癌细胞的增殖并促进凋亡[10]。HE等[11]研究结果显示人类早期内皮祖细胞增殖能力的升高伴随着miR-3928水平的降低，提示miR-3928具有抑制细胞增殖的作用。XIA等[12]发现肺组织中miR-3928的表达水平与肺鳞状细胞癌患者的恶性表型和不良预后有关。并且miR-3928 可具有直接靶向抑制Dicer 蛋白表达的作用[13]。本研究预测并验证了miR-3928可直接靶向抑制p38MAPK的表达。

miRNA靶向mRNA的过程受到LncRNA的靶向调控。LncRNA是一类长链RNA，其长度超过200个核苷酸，不具有蛋白质翻译功能。LncRNA可以通过竞争内源性RNA的方式作为“海绵”“吸附”miRNA，从而调节miRNA在mRNA降解和翻译中的作用[14]。LncRNA通过靶向miRNA调节靶基因表达也是调节肿瘤细胞发生和发展的机制之一。本研究结果显示发现高水平的TTN-AS1的宫颈癌患者具有更短的无进展生存期，并且TTN-AS1的水平与MAPK14的转录水平正相关。并且也进一步验证了TTN-AS1与miR-3928之间存在靶向关系。TTN-AS1在多种肿瘤中发挥促癌作用，包括口腔鳞状细胞癌、肺腺癌及前列腺癌等[15-17]。本研究结果显示过表达TTN-AS1会显著抑制miR-3928的水平，促进p38MAPK的表达，并阻断miR-3928对p38MAPK的抑制作用。过表达miR-3928明显降低了细胞活力和细胞侵袭能力。而TTN-AS1能够上调细胞活力和细胞侵袭能力，抑制细胞凋亡。过表达TTN-AS1会显著阻断miR-3928对细胞生长、侵袭的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用。FU等[18]研究显示TTN-AS1可通过靶向抑制 miR-134-5p促进MBTD1的表达并抑制骨肉瘤细胞的凋亡和促进耐药。JIA等[19]发现TTN-AS1可通过靶向miR-142-5p/CDK5促进肺癌细胞的迁移和侵袭。本研究结果显示在宫颈癌中，TTN-AS1通过靶向miR-3928促进细胞生长和侵袭，抑制凋亡。

综上所述，miR-3928靶向抑制p38MAPK的表达，TTN-AS1可通过直接靶向miR-3928上调p38MAPK的水平。TTN-AS1通过靶向调控miR-3928/p38MAPK促进CasKi细胞的增殖和侵袭并抑制凋亡。关于TTN-AS1和miR-3928在宫颈癌患者中的临床意义值得进一步研究，关于TTN-AS1和miR-3928通过p38MAPK调节宫颈癌进展的作用尚待进一步的体内研究。