子痫前期患者血清代谢物水平及其与疾病严重程度的相关性研究*

樊娜娜,詹 瑛△,徐 文,王 青,种莹莹,刘世国

青岛大学附属医院:1.产科;2.药学部,山东青岛 266003;3枣庄市妇幼保健院产科,山东枣庄 277000

子痫前期是在妊娠20周以后发生的以高血压和蛋白尿(或脏器损害)为特征的多器官疾病，可严重影响母婴健康。将高血压和蛋白尿作为子痫前期的诊断标准，远不足以体现子痫前期的病理生理学特征[1]，且诊断后再进行干预为时已晚。目前认为，子痫前期发病主要与胎盘浅着床、免疫反应、血管内皮受损、遗传因素、炎性反应、胰岛素抵抗等有关[2]。有研究者报道甜菜碱具有抗氧化、降压作用,脯氨酸对机体应激有保护活性,溶血性磷脂酰胆碱可损伤内皮细胞[3-4]。这些小分子可能参与子痫前期的发生、发展。有学者用电喷雾液质联用四级杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF)设备监测出甜菜碱和脯氨酸是诊断重度子痫前期潜在灵敏和特异的生物标志物[5]，谭兵等[6]用LC-Q-TOF设备筛选出1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(LPC18:0)在重度子痫前期孕妇及健康孕妇存在差异。L-异亮氨酸是人体内必需支链氨基酸，丙氨酸水平增加导致儿茶酚胺水平升高，有研究发现子痫前期孕妇血清L-异亮氨酸和苯丙氨酸水平升高[7]。然而LC-Q-TOF设备侧重于定性分析，而液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)专注于定量分析。LC-MS/MS是一种代谢组学技术，其代谢谱的分析技术是针对性的，对预设代谢物进行定量或半定量测定，验证出有意义的生物标志物，而且在测定标本前经过系统的方法学验证，结果更准确。本文利用LC-MS/MS对可能与子痫前期有关的小分子代谢物如甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0、L-异亮氨酸、苯丙氨酸进行验证性研究。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年5—12月青岛大学附属医院就诊的子痫前期患者共40例作为观察组，包括轻度子痫前期组孕妇20例，重度子痫前期组孕妇20例，另选取同期健康孕妇20例作为对照组。重度子痫前期、轻度子痫前期的诊断标准依据妊娠期高血压疾病诊治指南(2015)[8]，子痫前期定义为妊娠20周后出现收缩压≥140 mm Hg和(或)舒张压≥90 mm Hg，且伴有下列任一项：尿蛋白≥0.3 g/24 h，或尿蛋白/肌酐比值≥0.3，或随机尿蛋白≥(+)，血压和(或)尿蛋白水平持续升高，发生母体器官功能受损或胎盘-胎儿并发症是子痫前期病情向重度发展的表现。排除标准：慢性高血压、肾病、糖尿病、心血管疾病、肝病、多胎妊娠、自身免疫性疾病、甲状腺疾病等。所有纳入研究的孕妇均签署了知情同意，并经青岛大学附属医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 Agilent 1290Ⅱ高效液相色谱仪(配备G7120高压二元泵，G7167B自动进样器，G7116B柱温箱，美国Agilent 公司)；API4000+三重四极杆串联质谱系统，Analyst 1.6.3质谱数据处理软件(美国AB公司)。

甜菜碱(纯度99%)、脯氨酸(纯度99%)、苯丙氨酸(纯度99%)、LPC18:0(纯度>99%)、L-异亮氨酸(纯度99%)由上海蔚霆生物科技有限公司提供；甲醇、乙腈和甲酸(色谱纯,德国Merck公司)。

1.3方法

1.3.1样品预处理 采集研究对象晨起空腹静脉血液5 mL于促凝管中，3 000 r/min速度的条件下离心10 min，取上清液作为样品储存于-80 ℃冰箱中。将样本血清4 ℃解冻后,取100 μL与30 μL甲醇混合，涡旋振荡30 s后,4 ℃下静置5 min。将混合物在4 ℃，离心半径为8 cm，12 000 r/min的条件下离心5 min，取5 μL上清液得到待测样品。

1.3.2样本分析 色谱条件色谱柱为Ultimate AQ-C18 column(3.0 μm,2.1 mm×100 mm，上海月旭科技有限公司)；流动相乙腈(A)-0.1%的甲酸溶液(B)梯度洗脱(0.0～0.5 min，8% A；0.5～1.0 min，8%→100% A；1.0～6.0 min，100% A)；流速为0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量为5 μL。质谱条件采用电喷雾离子源(ESI)。(1)正离子模式，质谱参数：碰撞气6×104Pa，气帘气2×105Pa，雾化气4.48×105Pa,辅助气4.48×105Pa，喷雾电压5 500 V，雾化温度550 ℃。(2)负离子模式,质谱参数：碰撞气6×104Pa，气帘气2×105Pa，雾化气4.48×105Pa,辅助气4.48×105Pa,喷雾电压4 500 V,雾化温度550 ℃。甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0、L-异亮氨酸的质谱条件采用电喷雾离子源为正离子模式，苯丙氨酸的质谱条件采用电喷雾离子源为负离子模式，具体多反应监测(MRM)条件见表1。

表1 甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0、L-异亮氨酸、苯丙氨酸的 MRM条件

2 结 果

2.1各组孕妇临床资料比较 重度子痫前期组、轻度子痫前期组在年龄、体质量指数、分娩孕周方面与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组临床资料比较

2.2典型色谱图 甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0、L-异亮氨酸、苯丙氨酸典型色谱图见图1。

2.3观察组和对照组血清指标水平比较 观察组血清LPC18:0水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4各组血清指标水平比较 重度子痫前期组血清甜菜碱、脯氨酸水平低于轻度子痫前期组、对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；重度子痫前期组、轻度子痫前期组血清LPC18:0水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；各组血清苯丙氨酸、L-异亮氨酸水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表3 观察组和对照组血清指标水平比较(μg/mL)

表4 各组血清指标水平比较(μg/mL)

注： A为甜菜碱、B为脯氨酸、C为LPC18:0、D为L-异亮氨酸、E为苯丙氨酸；1为对照组、2为观察组。

2.5血清甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0与子痫前期的病情程度相关性分析 血清甜菜碱与子痫前期的病情程度呈负相关(r=-0.317,P<0.05)，血清LPC18:0与子痫前期的病情程度呈正相关(r=0.618,P<0.05),血清脯氨酸与子痫前期的病情程度呈弱相关(r=-0.288,P=0.026)。

2.6血清甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0 诊断重度子痫前期患者的效能 应用重度子痫前期组和健康对照组血清甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0 3种代谢物水平制作诊断重度子痫前期患者的ROC曲线，血清甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0对于重度子痫前期患者有一定的诊断价值。3种代谢物联合检测重度子痫前期患者的AUC为0.907，具有较高的诊断价值。见表5。

表5 3种代谢物单独及联合检测对重度子痫前期患者的诊断价值

3 讨 论

子痫前期是发生在妊娠中晚期的疾病，但导致其发病的分子变化在妊娠早期就已经开始[9]。由于重度子痫前期严重影响母婴安全及预后，因此，寻找诊断重度子痫前期的标志物，对早期诊断及干预具有重要意义。代谢组学研究的一般为小分子，而这些小分子恰恰能够真实反映人体各系统的生理、病理状态,为临床诊治提供有力依据[10]。从本研究可以看出子痫前期患者与健康妊娠女性在血清代谢物上有区别。这些代谢物可能对子痫前期的病情诊断、评估、药物干预具有指导意义。

甜菜碱是甘氨酸的三甲基衍生物，可能通过减少机体缺氧-再灌注损伤[11]，产生氧化应激的抗氧化作用[12]，作为一种保护性因子参与胎盘缺血、缺氧，减少氧化应激等一系列反应的过程，从而达到抗氧化、降压作用[13]，故甜菜碱可能参与子痫前期的发生、发展。ODIBO等[14]通过UPLC-MS方法检测血清中酰肉碱和氨基酸明显升高。KOSTER等[15]利用超高效液相色谱串联质谱分析子痫前期和健康孕妇的血清样品发现血清牛磺酸及硬脂酰肉毒碱升高显著，而肉碱的合成需要甜菜碱的参与，故在子痫前期孕妇血清中，可出现甜菜碱的消耗过多而减低。本研究验证了重度子痫前期孕妇血清甜菜碱水平明显降低，说明甜菜碱在子痫前期的发病过程中起重要作用，可能作为一种保护性成分参与病情的发生发展，并且其检测重度子痫前期患者的AUC为0.725，灵敏度为70%，特异度为75%，对重度子痫前期患者有一定的诊断效能。本研究显示重度子痫前期孕妇甜菜碱水平明显低于轻度子痫前期组与对照组,且相关性分析结果证实这种代谢物与子痫前期病情程度呈负相关,说明妊娠期间这种代谢物水平降低可导致子痫前期发病风险增加，检测其水平可评估子痫前期的病情严重程度。另甜菜碱已被证明可以保护内脏，改善心血管系统，提高运动能力，是预防慢性病的重要营养素[16]。有研究者通过对一组病态模型小鼠补充甜菜碱后，小鼠的多种促炎细胞因子的表达和血液高凝状态得到逆转[17]。子痫前期疾病发生也与多种促炎因子表达有关，因此，补充甜菜碱有望作为治疗重度子痫前期的新靶点，治疗或延缓疾病子痫前期的进展，改善预后，这需要进一步的研究。

TANG等[18]的研究表明脯氨酸是一种容易释放的应激底物，通过调节缺氧诱导因子参与缺氧性疾病的发生、发展。子痫前期发病可能是一种胎盘缺氧性疾病[19]，脯氨酸可能作为一种应激保护活性作用的因子参与疾病的发生和发展[20]。本研究中脯氨酸在重度子痫前期孕妇血清中水平明显降低，检测重度子痫前期患者的AUC为0.722，灵敏度为60%，特异度为85%。但是目前关于脯氨酸的研究不多，对机体的应激保护及减少机体缺氧等作用具体机制不清，需要进一步研究证实。

LPC18:0属于溶血性磷脂酰胆碱一种，近期的研究发现溶血性磷脂酰胆碱可促进平滑肌细胞的增殖，增加血管剪应，损伤内皮系统依赖的血管舒张功能，诱导血管内皮细胞的凋亡，损伤血管皮组织的连续性，促进血管炎性反应并影响了血小板聚集及血栓形成的过程[21-23]。可诱导淋巴细胞和巨噬细胞迁移，增加促炎细胞因子的产生，诱导氧化应激，促进细胞凋亡，从而聚集炎症，促进子痫前期的发展[24]。溶血磷脂酰胆碱作为最简单的水溶性甘油磷脂广泛参与脂质代谢，其异常说明了在子痫前期早期可能发生了脂代谢紊乱，参与疾病的发生、发展。本研究结果显示轻度子痫前期组孕妇血清LPC18:0水平明显高于对照组,并且LPC18:0有一定的诊断效能，其检测重度子痫前期患者的AUC为0.805，灵敏度为90%，特异度为65%。相关性分析显示血清LPC18:0水平与子痫前期的病情程度呈正相关,即LPC18:0水平越高,孕妇发生子痫前期风险越大,病情越重，故临床可根据其水平对病情进行预测，从而在疾病早期进行干预。根据以上研究，研究者有望在临床治疗子痫前期患者时通过降低这些溶血性磷脂水平，从而干预相关的脂质代谢通路，改善患者的症状。

血清甜菜碱、LPC18:0与子痫前期的病情程度具有相关性，测定其水平变化能判断子痫前期病情，在疾病早期进行干预及指导后续治疗。血清甜菜碱、脯氨酸、LPC18:0 检测重度子痫前期患者的AUC分别为0.725、0.722和0.805，对于重度子痫前期患者具有一定的诊断价值，3种代谢物联合检测重度子痫前期患者的AUC为0.907，具有较高的诊断价值，可更好地应用于临床；本研究未验证出 L-异亮氨酸及苯丙氨酸在子痫前期代谢中的特异性，考虑样本量小，还需进一步扩大样本量及检测范围。随着研究进展，联合不同代谢物及其他指标诊断子痫前期，可更好地发挥其临床应用价值。