先天性胆管扩张症患者转化生长因子β1、白细胞介素-32的表达水平及临床相关性分析*

吴宙光,王 斌,程 珍,张文杰,郑佳辰,李一帆

深圳市儿童医院普外二区，广东深圳 518026

先天性胆管扩张症(CBD)是一种良性的先天性胆道异常，以肝外和/或肝内胆管的囊性扩张为特征，该病通常发生在儿童时期，CBD常与胰胆交界处相关，并可与复发性胆管炎、肝硬化、胆总管结石、胰腺炎、胆管癌等长期并发症相关，表现为腹痛、呕吐和黄疸，大多数轻微儿童胆管炎患者可以保守治疗，而一些患有严重胆管炎的儿童需要胆汁引流，炎症得到控制后，行扩张胆管切除和肝管空肠吻合术[1-2]。但术前或术后常引起各类并发症导致病情迁移，而寻找有效的治疗靶点对疾病的诊断及治疗十分重要。转化生长因子β1(TGF-β1)属于转化生长因子家族的组成部分，主要介导细胞的生长、增殖和损伤修复[2]。白细胞介素-32(IL-32)主要由病原体和促炎细胞因子诱导，在免疫细胞中发挥重要作用，IL-32作为细胞因子是细胞信号通路的重要组成部分，参与细胞生长、代谢、激素信号、免疫等多种生理功能的调节。早期研究表明IL-32调节细胞生长、代谢和免疫，参与肝胆等免疫炎症性疾病的病理调节或作为保护剂[3-5]。本研究拟通过探讨CBD患儿中IL-32和TGF-β1的表达水平及其与临床指标的相关性研究，为进一步早期识别和治疗该类疾病提供坚实的理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年12月至2019年12月本院儿科住院收治的CBD患儿72例为研究组，其中男42例、女30例，年龄为9个月至14岁，平均(7.2±3.6)岁，另选取同期肝移植供体肝胆管组织正常的40例患者作为对照组，男26例、女14例，年龄为8个月至13岁，平均(7.0±3.8)岁，两组年龄、性别、体质量、手术时间、出血量等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究组均行手术根治性治疗，其中有2例急性梗阻性化脓性胆囊炎患儿进行胆总管造瘘术引流后再行手术治疗。两组研究对象知情并签署知情同意书。

1.2TGF-β1、IL-32水平及病理组织检测 所有研究对象采集空腹静脉血液5～10 mL，1 000 r/min室温下离心后取上清液，-80 ℃保存。获取研究组的肝组织和胆管组织标本，4%多聚甲醛固定后，于4 ℃保存，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法对所有研究对象的血清TGF-β1、IL-32水平进行检测，严格按照试剂盒步骤进行操作(武汉默沙克生物科技有限公司)。使用荧光定量PCR法检测肝组织TGF-β1、IL-32的mRNA相对表达水平，用Trizol法提取肝组织中RNA，逆转录为cDNA，采用荧光定量试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)配合相应体系在CFX96Touch荧光定量PCR仪上机反应(美国伯乐公司)，TGF-β1、IL-32的mRNA相对表达水平检测是基于基因表达阈值(Ct)的方法，即mRNA(2-ΔΔCt)进行计算，样本间重复3次。将患儿胆管组织标本进行常规病理检测[2]，根据不同病理程度(HE染色)可分为黏膜上皮细胞脱落(中度、重度)、肉芽组织增生(中度、重度)、管壁增生肥厚(中度、重度)、炎症细胞浸润(中等、大量)。免疫组化检测包括石蜡切片、脱蜡、封闭、修复抗原，采用相应的TGF-β1、IL-32抗体(上海赛默飞Invitrogen公司)进行检测，计算相应阳性细胞百分比。测定结果判读：在高倍镜下采用病理图像分析系统对免疫组化结果进行判定，胆囊壁、胆管壁切片中出现棕褐色或棕黄物为相应的TGF-β1及IL-32抗体阳性，不显色则为阴性。

1.3观察指标 两组研究对象的血清TGF-β1、IL-32水平及其肝组织中mRNA相对表达水平进行比较，分析CBD患儿肝功能指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、血清总胆汁酸(TBA)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GGT)]与血清TGF-β1、IL-32的相关性,以及CBD患者胆管不同病理程度的TGF-β1和IL-32表达情况。

2 结 果

2.1两组血清TGF-β1和IL-32水平及其肝组织中mRNA相对表达水平比较 研究组血清TGF-β1和IL-32水平较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。荧光定量PCR显示，研究组肝组织中TGF-β1和IL-32 的mRNA相对表达水平较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2CBD患儿肝功能指标与血清TGF-β1、IL-32的相关性 Pearson相关分析显示，CBD患儿的血清TGF-β1、IL-32与ALT、AST及γ-GGT水平呈正相关(P<0.05)。见表2。

表1 两组血清TGF-β1和IL-32水平比较

图1 两组肝组织中TGF-β1和IL-32 的mRNA相对表达水平比较

表2 CBD患儿肝功能指标与血清TGF-β1、IL-32的相关性

2.3CBD患者胆管不同病理程度的TGF-β1和IL-32的表达情况 CBD患者胆管不同病理程度的TGF-β1、IL-32表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 CBD患者胆管不同病理程度的TGF-β1和IL-32表达情况[n(%)]

3 讨 论

CBD是儿童高发性的胆道畸形疾病，目前发病率逐年上升，其发病机制尚不清楚，主要机制是胆管与胰管在十二指肠壁外合流的先天性畸形的解剖学因素，由于十二指肠乳头括约肌无法控制住合流部引起胆汁与胰液的逆流，导致胆道及胰腺相关性病理改变[6-8]。主要临床症状包括腹部上区包块、腹痛和黄疸，常合并胆囊炎、胆结石、胆道狭窄等症状，通常采用手术治疗，但存在多种并发症可能，甚至癌变[2,7]。因此，寻找潜在血清学生物标志物，对于疾病的诊断和防治十分重要。

TGF-β1是具有多种生物功能的细胞因子，在细胞的增殖、分化、瘢痕形成及免疫调节等方面至关重要，机体出现损伤后，TGF-β1在肌成纤维细胞中表达升高，而TGF-β1水平的升高又能促进细胞的增殖和分化，利于组织的损伤修复[9]。TGF-β1可诱导其他生长因子的生长促进胶原蛋白的合成，刺激纤维素生成，增强细胞与基质间的相互作用，同时能够减少细胞间基质蛋白的合成，下调金属蛋白酶的活性，促进组织生理修复，触发对组织的纤维化修复作用[10]。TGF-β1也可通过抑制过度的炎症，调节免疫炎症本身是组织修复的一个重要决定因素[11]。另外，TGF-β1还是诱导肝纤维化最重要的细胞因子，该细胞因子可通过TGF-β1/Smad信号传导通路直接激活肝卫星细胞，导致肝纤维化形成[12]。研究表明，TGF-β1在胆汁淤积性肝硬化、肝内胆管结石合并胆管狭窄患者中表达升高主要促进其向胆管细胞增殖分化[9,13]。本研究提示TGF-β1在CBD的表达上调，可促进胆道的纤维化增生[2]。近期病理组织免疫组化研究表明TGF-β1在CBD的胆管壁明显高于胆囊壁，说明胆管壁的损伤在CBD患者中更为敏感[2]，但本研究尚未进行相关的亚组分析，今后需扩大样本和分组分析进一步证实。本研究还发现，研究组肝组织中TGF-β1和IL-32 的mRNA相对表达水平较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；CBD患者胆管不同病理程度的TGF-β1、IL-32表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明TGF-β1和IL-32水平参与了CBD疾病的发生发展，可通过促进胆道细胞增殖分化、促进组织的修复，调节炎症免疫功能，有利于病情程度的判定和监测。

IL-32是一种新型的细胞因子，参与炎症和癌症的发生，其基因主要由8个小外显子组成，IL-32最初是通过有丝分裂原和激活的自然杀伤细胞在激活的T细胞中选择性表达的，在各种人体组织和器官中广泛表达，如肺、肝脏、肌肉、肾脏、胰腺和大脑[3]。既往研究表明，IL-32在多种炎症性疾病患者中上调，是一种主要的促炎因子，由炎性反应诱导免疫调节反应[3,5,14-15]。本研究中CBD患儿IL-32与病情严重度明显相关，考虑CBD患儿中主要是大量炎性因子的释放导致肝细胞损伤，触发一系列的生物学反应，促进肝纤维化发生，出现胆道狭窄，从而引起胆道的胆管扩张。

本研究中CBD患儿的TGF-β1、IL-32水平与肝功能指标(ALT、AST及γ-GGT)呈正相关，与以往研究结果较为一致[5]。其中TGF-β1可加重炎性反应和继发组织的纤维化[9]。IL-32水平升高与肝炎活动明显相关，主要是通过抑制核转录因子κB 信号通路或加强协同刺激分子B7-H6与自然杀伤细胞表面受体NKP30相互作用，可促进IL-32的表达，促进肝细胞凋亡[4]。肝功能指标(ALT、AST)在肝细胞受损时能够释放入血，是反映肝功能受损的常用指标[16]。由于胆管扩张易引起炎性反应和胆道梗阻性黄疸[4-5]。因此，CBD患儿TGF-β1、IL-32水平与肝功能严重度明显相关。

综上所述，TGF-β1、IL-32水平在CBD患儿中及疾病进展起着重要作用，其代表肝损伤的炎症程度和纤维化水平，为CBD患儿寻求靶向针对TGF-β1、IL-32的新型药物治疗方法的设计开辟了新的途径。