严重烫伤MODS小鼠的sTREM-1抗炎作用研究*

骆沿极，刘安娜，王占科，肖创清△，胡亚芳

1.湖南师范大学附属第二医院/中国人民解放军联勤保障部队第921医院检验科，湖南长沙 410000； 2.中国人民解放军联勤保障部队第908 医院检验科，江西南昌 330002

髓样细胞触发受体-1(TREM-1)是在单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞上表达的一种细胞表面受体。TREM-1与DNA激活蛋白12(DAP12)结合，引发细胞内信号级联反应，通过与Toll 样受体(TLR)信号的协同作用，触发并放大炎性反应，导致肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子释放[1-2]。细菌脂多糖(LPS)即内毒素的化学成分，剂量依赖性地增加细胞表面TREM-1的表达[3]。LPS的刺激会诱导TREM-1内源性配体的释放，释放的内源性配体功能性地激活TREM-1[2]。可溶性髓样细胞触发受体-1(sTREM-1)是TREM-l的可溶形式，具有TREM-1的胞外区(Ig样结构域)即负责配体结合的位点[4-5]。正常情况下sTREM-1/LPS比值应相对恒定。本研究探讨严重烫伤多器官功能障碍综合征(MODS)小鼠sTREM-1/LPS比值变化及sTREM-1的抗炎作用，以期对临床治疗MODS提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1材料 无特定病原体(SPF)级的昆明小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半[动物生产许可证号SCXK(赣)2018-0003，质量合格证号0001516 ]； LPS(Escherichia coli O55:B5，美国sigma公司)；TREM-1/Fc融合蛋白(美国R&D Systems公司)。

1.2仪器与试剂 HH-W21 型电热恒温水浴箱购自上海医用恒温设备有限公司。BS2000全自动生化分析仪购自深圳迈瑞生物技术有限公司。DL-ET32微生物动态检测系统由珠海迪尔生物工程有限公司生产。RT-3100全自动洗板机购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。KHB ST-360酶标仪由上海科华生物工程股份有限公司生产。UPT-3A 上转发光免疫分析仪由北京热景生物技术有限公司生产。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酐(CRE) 和肌酸激酶同工酶(CK-MB) 生化测定试剂盒由深圳迈瑞生物技术有限公司生产。LPS动态浊度法测定试剂盒由珠海迪尔生物工程有限公司生产。TNF-α和sTREM-1酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒由上海泽叶生物科技有限公司生产。IL-6上转发光法测定试剂盒由北京热景生物技术有限公司生产。

1.3动物模型制作及给药 本研究由中国人民解放军联勤保障部队第921医院伦理委员会批准。200 只SPF级的昆明小鼠无菌包装条件下，运送至解放军第908 医院动物实验室[许可证编号 SYXK(赣) 2013-001]，全膜终端过滤式独立送风环境下适应性喂养3 d，按随机数字表法分为烫伤1 d组(30只)、烫伤3 d组(30只)、烫伤5 d组(30只)、TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组(30只)、TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组(30只)、TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组(30只)和对照组(20只)。小鼠麻醉后背部剪毛，除对照组外浸入90 ℃水中10 s，达到30%体表面积Ⅲ度烫伤。伤后 2 h 小鼠腹腔注射1.0 mL LPS(按5 mg/kg体质量注射：0.1 mg/mL)，同时腹腔注射1.0 mL生理盐水抗休克。烫伤1 d组、烫伤3 d组和烫伤5 d组小鼠的肝功能、肾功能和心肌酶等指标高于对照组，表示严重烫伤MODS小鼠模型制作成功[6-8]。将对照组小鼠背部浸入室温水中10 s，除假烫伤和不注射LPS外，其他处理方式均与烫伤1 d组、烫伤3 d组、烫伤5 d组相同。LPS注射1 h后，TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组、TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组、TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组小鼠腹腔注射0.2 mL用磷酸盐缓冲液(PBS)配制的TREM-1/Fc融合蛋白溶液(按1 μg/kg体质量注射：0.1 μg/mL)[9-10]。TREM-1/Fc融合蛋白溶液需现配现用。其他组注射等体积PBS。

1.4标本采集及指标测定 各组小鼠麻醉后进行心脏采血[11]。所有小鼠在采血前禁食12 h，可以自由饮水。各组的死亡小鼠未进行采血(小鼠死亡时间不固定)。烫伤1 d组和TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组在烫伤后第1天采血。烫伤3 d组和TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组在烫伤后第3天采血。烫伤5 d组和TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组在烫伤后第5天采血。对照组适应性喂养3 d后空腹12 h即可采血。血液用肝素钠抗凝。离心后，分离血浆并保存在-80 ℃的冰箱中。测量相关指标时，各组小鼠血浆统一冻融，严格按照指标的检测试剂盒说明书测定。ALT(IFCC法)、CRE(肌氨酸氧化酶法)和 CK-MB(免疫抑制法)在BS2000全自动生化分析仪上进行测定。LPS(动态浊度法)在DL-ET32微生物动态检测系统进行测定。sTREM-1(ELISA法)和 TNF-α(ELISA法)在KHB ST-360酶标仪上进行测定。IL-6(上转发光法)在UPT-3A 上转发光免疫分析仪上进行测定。

2 结 果

2.1各组小鼠病死率情况比较 烫伤1 d组小鼠病死率(13.33%)和TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组(6.67%)比较，差异无统计学意义(P>0.05)；烫伤3 d组小鼠病死率(33.33%)和TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组(16.67%)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组小鼠病死率(20.00%)小于烫伤5 d组(50.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2各组小鼠主要脏器功能指标水平比较 烫伤1 d组、烫伤3 d组、烫伤5 d组小鼠ALT、CRE 和CK-MB高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组、TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组、TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组小鼠ALT、CRE 和CK-MB高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。烫伤1 d组小鼠ALT、CRE、CK-MB和TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组小鼠ALT、CRE 和CK-MB低于烫伤3 d组，差异有统计学意义 (P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组小鼠ALT、CRE和CK-MB低于烫伤5 d组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠 ALT、CRE 和CK-MB水平比较

2.3各组小鼠血浆sTREM-1/LPS比值比较 烫伤1 d组[(8.82±1.06)]、烫伤3 d组[(6.78±0.93)]、烫伤5 d组[(7.37±0.86)]和TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组[(6.47±0.89)]、TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组[(4.85±0.72)]、TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组小鼠血浆sTREM-1/LPS比值[(5.41±0.84)]与对照组[(32.99±3.14)]比较，差异有统计学意义(P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组血浆sTREM-1/LPS比值[(6.47±0.89)]低于烫伤1 d组[(8.82±1.06)]，差异有统计学意义 (P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组血浆sTREM-1/LPS比值[(4.85±0.72)]低于烫伤3 d组[(6.78±0.93)]，差异有统计学意义 (P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组血浆sTREM-1/LPS比值[(5.41±0.84)]低于烫伤5 d组[(7.37±0.86)]，差异有统计学意义 (P<0.05)。

2.4各组小鼠TNF-α和IL-6水平比较 烫伤1 d组、烫伤3 d组、烫伤5 d组小鼠TNF-α和IL-6高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组、TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组、TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组TNF-α和IL-6高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组小鼠TNF-α和IL-6低于烫伤1 d组，差异有统计学意义(P<0.05)；TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组小鼠TNF-α和IL-6低于烫伤3 d组，差异有统计学意义(P<0.05)；TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组小鼠TNF-α和IL-6低于烫伤5 d组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠 TNF-α和IL-6水平比较

3 讨 论

MODS是重症患者最常见的危重症候群之一，也是导致重症患者死亡的主要原因[7]。败血症是MODS最常见的诱因，通常使用LPS进行研究。严重创伤和LPS诱发强烈的全身性炎症反应综合征(SIRS)，失调的免疫反应导致促炎和抗炎之间的稳态失衡，这是MODS发展的关键[12-13]。诱发因素、SIRS和多器官功能障碍是MODS诊断的重要依据[6]。肝、肾和心是人类MODS常累及的器官种类，ALT属于肝功能指标，CRE属于肾功能指标，CK-MB属于心肌酶谱。本研究采用烫伤加腹腔注射LPS的二次打击模型，诱因明确，器官功能指标与严重烫伤MODS大鼠模型相同。在严重烫伤MODS大鼠模型中，烫伤后各时点 ALT、CRE和CK-MB 高于烫伤前，并持续到烫伤后数天，表明多脏器出现功能明显异常[14-15]。本研究中，烫伤1 d组、烫伤3 d组和烫伤5 d组小鼠ALT、CRE和CK-MB高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，多个重要器官功能指标出现明显异常，表明严重烫伤MODS 小鼠模型制作成功。小鼠炎性因子TNF-α和IL-6水平也升高，表明严重烫伤MODS小鼠同时具有内毒素血症、SIRS和多器官功能障碍。

LPS的诱导是TREM-1激活所必需的，LPS剂量依赖性地增加细胞表面TREM-1的表达[2-3]，TREM-1的胞外区切下[5]或TREM-1 mRNA的剪接变体翻译[1]形成sTREM-1，表明正常情况下sTREM-1/LPS比值相对恒定。本研究运用sTREM-1/LPS比值评估小鼠血浆sTREM-1相对LPS是否缺乏，结果显示,烫伤1 d组、烫伤3 d组、烫伤5 d组小鼠血浆sTREM-1/LPS比值与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。sTREM-1缺乏跨膜和细胞内结构域，因此缺乏信号转导特性，但它具有TREM-1的胞外域，即负责配体结合的位点[4]。严重烫伤MODS小鼠发生内毒素血症，但与健康小鼠对比，血浆sTREM-1相对LPS不足，原因可能是sTREM-1与细胞表面TREM-1竞争结合TREM-1内源性配体导致血浆中游离的sTREM-1相对不足[16]。若释放的sTREM-1足够，在与内源性配体结合后，血浆sTREM-1/LPS比值仍应与对照组接近。TREM-1激活后触发并扩大炎性反应[5]，sTREM-1充当诱饵受体与TREM-1内源性配体结合，抑制了TREM-1的活化，因此，sTREM-1可能起抗炎作用[4,10]。TREM-1/Fc融合蛋白为包含鼠TREM-1胞外域和人IgG1 Fc部分的融合蛋白，相当于sTREM-1，具有负责配体结合的位点[10,17]。与未接受治疗的MODS小鼠对比，TREM-1/Fc融合蛋白治疗的小鼠血浆sTREM-1/LPS比值降低，即sTREM-1相对LPS进一步降低，原因可能是注入了足量的TREM-1/Fc融合蛋白，其代替sTREM-1充当诱饵受体。虽然LPS刺激会诱导TREM-1内源性配体的释放，这种内源性配体能够功能性激活TREM-1[2]，但TREM-1/Fc融合蛋白竞争结合释放的内源性配体，激活TREM-1的配体数量减少，TREM-1的表达减少，产生的sTREM-1也就相对减少。因此，sTREM-1/LPS比值有两种意义。在进行TREM-1/Fc融合蛋白(或sTREM-1)治疗前，sTREM-1/LPS比值可用于评估血浆sTREM-1相对LPS是否缺乏，若缺乏则下降；在进行TREM-1/Fc融合蛋白(或sTREM-1)治疗后，sTREM-1/LPS比值可用于评估TREM-1/Fc融合蛋白是否有效及用量是否足够，若足够则进一步下降。

TNF-α和IL-6均为促炎细胞因子，在炎性反应中起着重要作用[18-19]。激活TREM-1能够触发并扩大炎性反应，促进炎性反应的发生、炎症介质的产生，包括TNF-α和IL-6[5]。TREM-1/Fc融合蛋白为包含鼠TREM-1胞外域和人IgG1 Fc部分的融合蛋白，相当于sTREM-1，具有负责配体结合的位点[10,17]。为了验证sTREM-1的抗炎作用，将TREM/Fc融合蛋白溶液注入小鼠体内，观察到TREM-1/Fc融合蛋白治疗1 d组小鼠TNF-α和IL-6低于烫伤1 d组，TREM-1/Fc融合蛋白治疗3 d组小鼠TNF-α和IL-6低于烫伤3 d组，TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组小鼠TNF-α和IL-6低于烫伤5 d组，差异有统计学意义(P<0.05)，TREM-1/Fc融合蛋白治疗5 d组小鼠病死率小于烫伤5 d组(P<0.05)。以上结果证实了TREM-1/Fc融合蛋白或sTREM-1具有抗炎作用并能有效降低MODS的病死率。

烫伤加腹腔注射LPS的二次打击模型能更好地复制人类烫伤MODS。烫伤后感染造成的内毒素血症是导致烫伤MODS的重要原因[20]。尽管烫伤后自然感染或创面接种细菌的方法更接近人类烫伤MODS的发生过程，但这些方法存在不足，如模型不稳定，复制时间较长等。本研究采用的烫伤MODS模型，腹腔注射的LPS剂量容易控制，复制时间较短，形成MODS的时间比较集中，烫伤小鼠MODS表现典型，而且制作严重烫伤MODS模型，只探讨sTREM-1在严重烫伤MODS中的抗炎作用，所得实验结果与单纯的烫伤模型实验结果是否存在差异，尚需进一步研究。