祥云县蝙蝠粪便中携带的病毒调查研究

2021-03-17董兴齐

科学咨询 2021年6期

潘虹冯云董兴齐

（1.大理大学云南大理 671000；2.云南省地方病防治所病毒立克次体病防治科云南大理 671000；3.云南省传染病专科医院云南昆明 650000）

蝙蝠是一类古老的翼手目哺乳动物，是病毒“存储库”。蝙蝠的数量占哺乳动物的1/5。地球上的蝙蝠有1 100多种，进化了将近5千万年[1]。蝙蝠分为大蝙蝠亚目和小蝙蝠亚目。大蝙蝠通常食用花蜜、花粉、水果等。小蝙蝠亚目的蝙蝠多食用动物血，捕食昆虫、鱼类，有时候也食用少量水果。蝙蝠是一类群居动物，种群数量往往成千上万，多数在夜间活动，四处飞行觅食。在气温较冷的冬季，它们会选择冬眠（降低身体代谢率，从而减少能耗）或迁徙[2]。蝙蝠的特殊免疫机制及生活环境使其具有强大的带毒能力。随着人类活动范围扩大，蝙蝠与人类接触越来越密切、频繁，成为蝙蝠传播病毒到家畜与人类的一大诱因[1]。

既往研究报道过，国内外多个团队在蝙蝠的粪便中进行宏基因学检测[3]，查到相关的病毒核酸片段，包括RNA病毒与DNA病毒：腺病毒属[3-4]、疱疹病毒属[3-4]、异样疱疹病毒属[4]、乳头瘤状病毒属[5]、正嗜肝病毒属[5]、A型轮状病毒属[5]、α冠状病毒属[3]、β冠状病毒属[3]、肠道病毒属、丙肝病毒属等。

一、材料与方法

（一）标本采集

本实验组于2017年7月、8月在祥云县清华洞内（经纬度100°E，25°N，环境21℃～23℃，海拔1 980～1 998 m）采集蝙蝠粪便标本480份。经现场形态学初步分类鉴定，蝙蝠种类有水鼠耳蝠（Water bat）和棕果蝠（Rousettus leschenaultii）两种。粪便标本的采集分为2种方式：1.对捕获的蝙蝠用肛拭子采集后放飞；2.若采集肛拭子时蝙蝠死亡，则解剖蝙蝠，取距肛门处2厘米直肠。所有样本现场保存于液氮中，带回实验室。

（二）主要试剂及仪器设备

主要试剂：DNA提取试剂盒(天根)、RNA提取试剂盒(QiAgen)、逆转录试剂盒Ready-to-go、PCR mix(Promega/Takara)、PBS缓冲液(速研)、标准琼脂糖(Invetrigen公司)、DL2000 DNA Marker(Takara公司)。主要仪器设备：-80℃冰箱(海尔)、生物安全柜(Niuer)、移液器、水浴锅、冷冻离心机、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪。

二、实验步骤及方法

（一）提取总RNA、逆转录制备cDNA文库

共480份，同种、同属5份蝙蝠样品合并为一份，合并后共96份样本。将QiAgen试剂盒（50kit）中的所有液体在使用前按照说明书配好，按照说明书提取总RNA。用Ready-to-go试剂盒，按照说明书操作，逆转录制备cDNA文库。

（二）DNA的提取

用天根试剂盒提取DNA，在使用试剂盒前将盒子准备好，按照说明书提取样本DNA。

（三）引物

引物由上海生工合成，使用浓度为10 pmol/μl。

表1 引物信息

（四）序列测定和分析

对PCR扩增阳性的产物进行序列测定，所有测序在生工生物工程（上海）股份有限公司昆明办事处完成。使用DNAstar软件包中的SeqMan对序列片段进行拼接、编辑、校正；应用MEGA 5.0软件邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树。

三、结果

（一）蝙蝠携带的DNA病毒情况

本次实验检测祥云县清华洞内蝙蝠粪便中携带的1种DNA病毒（腺病毒扩增1种基因片段）和5种RNA病毒（轮状病毒扩增3个基因片段，其余4种病毒包括肠道病毒、黄病毒、乙脑病毒、甲病毒每种病毒扩增1种基因片段），共扩增8个基因。5种RNA病毒检测结果阴性。DNA病毒腺病毒阳性84份样本。

腺病毒电泳结果图1所示，所有标本电泳结果有84份阳性，目标片段261bp，随机抽取5份送去测序。

图1 腺病毒电泳结果（目标片段261bp）

（二）病毒基因片段的测序及分析

在NCBI数据库中进行Blast比对后，腺病毒与2010年发现的蝙蝠源哺乳动物腺病毒Bat adenovirus isolate 1285-YNMr（No.GU226966）核苷酸序列相似度为96%，该病毒属于双链DNA病毒腺病毒科未分类哺乳动物腺病毒属。

KY009650是来自中国南方发现的蝙蝠腺病毒。本次实验的蝙蝠粪便中的腺病毒与2007年云南蝙蝠粪便中的腺病毒有较高的亲缘关系。

四、讨论

本次实验中其他病毒未检测到，并不能说明蝙蝠粪便中无该病毒的存在。就RNA病毒来说，由于蝙蝠粪便中污染严重，提核酸、逆转录、PCR扩增容易实验失败，往往检测不出。因此，研究者考虑尝试使用宏基因学的方法，可以充分利用样本，探查蝙蝠粪便内的其他病毒。

本次实验的蝙蝠粪便中的腺病毒与2007年云南蝙蝠粪便中的腺病毒有较高的亲缘关系，说明腺病毒在云南蝙蝠体内检出率高。腺病毒作为1950年就发现的病毒，人类对其研究比较多。腺病毒可感染多种脊椎动物，鱼类、爬行动物、两栖动物、鸟类、哺乳动物，以往在蝙蝠体内也曾检测出，说明携带腺病毒的物种比较广、数量多。

1953年，科研工作者首次从婴儿的呼吸道感染扁桃体中分离得到腺病毒。腺病毒是一种双链DNA病毒，无包膜由252个壳粒呈二十面体排列包裹而成，一颗内包裹的双链DNA两端各有大约100bp的反向重复序列。腺病毒分为A、B、C、D、E、F、G 7个亚群（subgroup），基因型已经鉴定出超过100种。人腺病毒 (Humanadenovirus，HAdV) 属于腺病毒科 (Adenoviridae)哺乳动物腺病毒属Mastadenovirus。腺病毒能感染、眼、胃肠道、呼吸道、尿道和膀胱，较常发生在眼角膜和呼吸道。

本次研究中检测出的腺病毒基因片段在进化树蝙蝠腺病毒分支上与云南蝙蝠、中国北方的蝙蝠腺病毒处于同一分支，说明还是具有一定的相似性。但是，本次的5个病毒株在次级分支是独立成一支，说明与之前发现的蝙蝠腺病毒还是稍有不同，尤其是XYBF201710、XYBF201730、XYBF201740、XYBF201755在同一簇，而XYBF201784独立成一簇，表明XYBF201784与其他几株还是有不同，可能存在变异。2007～2008年，葛兴义等在一批云南省的蝙蝠粪便内检测出蝙蝠腺病毒，并且分离出蝙蝠腺病毒毒株TJM。该病毒能引起哺乳动物细胞发生细胞病变。这提示蝙蝠体内的腺病毒与哺乳动物甚至人类疾病有一定关系。蝙蝠生活在潮湿的洞穴中，肛拭子检测出的腺病毒至少提示了祥云县的蝙蝠携带腺病毒，但实际感染率应该高于试验检测的阳性率，因为肛拭子还存在保存不当、核酸提取不出或样本的病毒量太少等问题。腺病毒主要通过呼吸道传播。蝙蝠长期群居为腺病毒在种群间传播创造了便利条件。此次调查腺病毒在祥云清华洞蝙蝠中的流行情况有助于评估病毒传染人类的潜在危险性，对疾病的防控具有指导意义。