结直肠癌中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表达及临床意义

谭 林，陈维顺，周红兵，王 骞，艾琼嘉，屈伟明

粒状头样3(Grainyhead-like 3, GRHL3)是一种转录因子，为高度保守的Grainyhead家族成员之一。最近研究发现，GRHL3不仅在正常生长发育过程中，如皮肤屏障形成、伤口愈合、眼睑及神经管闭合、内皮细胞的迁移和调亡等方面发挥关键作用，而且参与肿瘤相关靶基因和信号通路的调控，与肿瘤的增殖、凋亡、转移和侵袭等密切相关[1]。但目前国内外关于GRHL3在结直肠癌中的报道较少。本实验采用免疫组化SP法检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中GRHL3、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白E-cadherin和Ki-67的表达，探讨三者表达与结直肠癌临床病理特征以及患者预后的关系，以期为结直肠癌的早期诊断及评估预后提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2014年2月～2015年2月中南大学湘雅医学院附属株洲医院存档的100例结直肠癌根治术标本及其中30例相应的癌旁正常肠黏膜组织标本(均为手术切缘，病理证实无癌浸润)。患者术前均未接受放、化疗，所有标本均经术后病理证实。其中男性63例，女性37例，年龄27～84岁，中位年龄62岁。纳入标准：(1)病理诊断为结直肠癌；(2)患者术前未行放、化疗；(3)行结直肠癌根治术；(4)临床及病理资料均完整，可追踪随访。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)有严重心、肝、肾等重要脏器功能损害或其他严重基础疾病者。所有患者对本实验均知情，组织标本的获取和使用均获得我院伦理委员会批准同意。根据国际癌症控制联盟(UICC)和美国癌症联合委员会(AJCC)结直肠癌TNM分期系统推荐的TNM分类系统(第8版)，对病理切片进行评估。所有标本均经10%中性福尔马林固定后，脱水、透明、浸蜡，包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 试剂兔抗人GRHL3多克隆抗体(PA5-41616)购自美国Invitrogen公司，鼠抗人E-cadherin单克隆抗体(MAB-0738)、鼠抗人Ki-67单克隆抗体(MAB-0672)均购自福州迈新公司。SP试剂盒、DAB显色剂、中性树胶封片剂均购自北京中杉金桥公司。二甲苯、无水乙醇、石蜡、PBS缓冲液、枸橼酸钠缓冲液均购自广州瑞斯生物公司。

1.3 免疫组化常规脱蜡、水化，枸橼酸高压修复2.5 min，H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，正常山羊血清封闭，滴加一抗(GRHL3，稀释度为1 ∶800，E-cadherin和Ki-67均为抗体原液)，孵育过夜，复温45 min，滴加通用型二抗，置于室温孵育25 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，显微镜镜检及图像采集分析。

1.4 结果判读由病理医师采用双盲法阅片，以细胞膜/细胞质/细胞核中出现黄色或黄褐色颗粒为阳性。免疫组化计分包括染色强度及阳性细胞比例。(1)按染色强度分级：无染色或与背景一致的浅黄色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。按阳性细胞比例分级：每片随机观察5个高倍镜视野(200×)，计算阳性细胞所占比例：阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。将两项得分结果相加：0～3分为阴性，4～6分为阳性。

1.5 随访自患者手术起通过门诊或电话定期随访，每半年随访1次，随访截至2020年2月，以患者死亡、失访或最后随访时间为终点，随访内容主要为患者生存情况，总生存期定义为自患者入组开始至因任何原因死亡的时间。

1.6 统计学分析采用SPSS 26.0软件对统计数据进行分析。计数资料以相对数指标(%)表示，采用χ2检验；相关性分析采用χ2检验及Spearman等级相关分析；采用Kaplan-Meier法计算生存率、组间生存曲线的比较采用Log-rank检验；采用Cox比例风险回归模型分析GRHL3、E-cadherin和Ki-67表达与患者预后的关系。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁正常组织中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表达GRHL3表达主要定位于细胞质，E-cadherin表达主要定位于细胞质和细胞膜，Ki-67表达主要定位于细胞核。结直肠癌组织中GRHL3和Ki-67阳性率(64.0%和60.0%)高于癌旁正常组织(30.0%和6.7%)，结直肠癌组织中E-cadherin阳性率(55.0%)低于癌旁正常组织(99.7%)，差异均有统计学意义(P<0.05，表1，图1、2)。

2.2 GRHL3、E-cadherin和Ki-67表达与结直肠癌临床病理特征的关系结直肠癌组织中，GRHL3和Ki-67的表达与肿瘤大小密切相关，差异有统计学意义(P<0.05)，GRHL3和E-cadherin的表达与TNM分期、浸润深度及淋巴结转移密切相关，差异均有统计学意义(P<0.05)，三者表达均与患者性别、年龄、分化程度无关(表2)。

2.3 结直肠癌组织中GRHL3、E-cadherin与Ki-67表达的相关性采用Spearman等级相关分析100例结直肠癌组织中GRHL3与E-cadherin和Ki-67的表达，结果显示，GRHL3与E-cadherin的表达呈负相关(χ2=6.674，P=0.010，rs=-0.260)，GRHL3与Ki-67的表达呈正相关(χ2=7.799，P=0.005，rs=0.281，表3)。

表1 结直肠癌组织和癌旁正常组织中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表达

表2 GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表达与结直肠癌临床病理特征的关系

表3 结直肠癌组织中GRHL3与E-cadherin和Ki-67表达的相关性

图1 结直肠癌组织中GRHL3(A)、E-cadherin(B)和Ki-67(C)的表达，SP法 图2 癌旁正常组织中GRHL3(A)、E-cadherin(B)和Ki-67(C)的表达，SP法

2.4 结直肠癌组织中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表达与患者预后的关系本组100例结直肠癌患者均获得完整随访资料，通过Kaplan-Meier生存曲线及Log-rank检验比较结直肠癌组织中GRHL3、E-cadherin和Ki-67的表达与患者预后的关系(图3)。结果显示，GRHL3阳性患者5年总生存率为43.8%，GRHL3阴性患者5年总生存率为80.6%，差异有统计学意义(P<0.001)。Ki-67阳性患者5年总生存率为46.7%，Ki-67阴性患者5年总生存率为72.5%，差异有统计学意义(P=0.017)。E-cadherin阳性患者5年总生存率为72.7%，E-cadherin阴性患者5年总生存率为37.8%，差异有统计学意义(P<0.001)。单因素Cox回归分析显示，TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、GRHL3阳性、E-cadherin阴性及Ki-67阳性与结直肠癌患者预后有关(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、GRHL3阳性、E-cadherin阴性是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05，表4)。

图3 结直肠癌组织中GRHL3(A)、E-cadherin(B)和Ki-67(C)的表达与患者预后的关系

表4 Cox回归分析结直肠癌患者预后的影响因素

3 讨论

GRHL3可以促进某些细胞的增殖、变形、运动和迁移，由于其在这些方面的功能与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭具有高度的相似性，或两者是一致的，导致近年关于GRHL3在肿瘤中的作用成为学者们的研究热点。有研究发现，GRHL3在乳腺癌[2]、弥漫大B细胞淋巴瘤[3]、食管鳞状细胞癌[4]、胃癌[5]中高表达，且与患者临床分期及预后密切相关。在乳腺癌细胞中GRHL3可特异性与E-cadherin近端启动子上的E-box相互作用抑制E-cadherin的表达，从而诱导EMT，促进侵袭和迁移[6]。亦有研究发现[7]在皮肤鳞状细胞癌中GRHL3作为依赖miR-21原致癌网络的靶点之一，担任着保护性角色。由此可见，GRHL3在不同类型肿瘤中的作用不尽相同，且有可能相互矛盾。

E-cadherin是一种Ca2+依赖黏附分子，其表达的缺失是EMT最重要的标志性变化，也是上皮肿瘤细胞发生侵袭、转移的前提条件[8]。Ki-67是一种由两条多肽链组成与有丝分裂密切相关的蛋白，存在于增殖活跃细胞的G1、S、G2和M期中，能够比较准确地反映细胞的增殖状态，是一种应用最广泛的增殖细胞标志物之一[9]。本组实验结果显示，结直肠癌中E-cadherin的阳性率明显低于癌旁正常组织，而Ki-67则正好相反。E-cadherin的表达水平与TNM分期、浸润深度、淋巴结转移有关，Ki-67的表达水平与肿瘤大小关系密切。Kaplan-Meier生存分析提示，E-cadherin阴性结直肠癌患者的5年生存率明显低于阳性患者，而Ki-67阳性结直肠癌患者的5年生存率明显低于阴性患者。单因素Cox回归分析显示，E-cadherin和Ki-67的表达均与结直肠癌患者预后有关；多因素Cox回归分析显示，E-cadherin阴性是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素。结合既往研究，实验进一步证实E-cadherin和Ki-67可作为评价结直肠癌发生、发展的重要指标。

Wang等[10]通过对进展期结直肠癌组织和癌旁组织行微阵列分析，结果显示GRHL3在结直肠癌中占主导地位，且下调GRHL3的表达可抑制结直肠癌细胞的体外增殖、侵袭和迁移及使G0/G1期细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。本实验结果显示，GRHL3在结直肠癌中的表达明显高于癌旁正常组织，提示GRHL3在结直肠癌中可能发挥促癌作用。GRHL3的表达与肿瘤大小、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移密切相关，证实GRHL3可能与结直肠癌的进展密切相关。进一步分析发现，GRHL3的表达与EMT相关标志物E-cadherin的表达呈负相关，提示GRHL3可能通过影响E-cadherin的表达参与EMT的发生，促进结直肠癌的侵袭、转移；GRHL3的表达与增殖细胞标志物Ki-67的表达呈正相关，提示GRHL3可能与肿瘤细胞增殖有关。此外，GRHL3阳性患者5年生存率明显低于阴性患者，同时多因素Cox回归分析均显示GRHL3阳性是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素。故作者推测GRHL3可能通过诱导EMT的发生和细胞的异常增殖，导致结直肠癌的发生、发展和侵袭、转移，进而影响患者预后。

综上所述，GRHL3在结直肠癌中高表达，且可能与E-cadherin和Ki-67之间存在一定相互作用，三者在结直肠癌的进展中发挥重要作用，可作为评估结直肠癌患者预后的潜在分子标志物。进一步探讨GRHL3与E-cadherin和Ki-67之间相互作用的具体分子机制，有望为结直肠癌的生物靶向治疗提供新思路。