错配修复蛋白表达及RAS基因突变与结直肠癌临床病理特征的关系

谢乐斯，赵 盼，周 虹，王 炜，项晶晶

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于肺癌、乳腺癌和前列腺癌[1]，近年我国结直肠癌的发病率和病死率均呈逐年升高趋势。目前，错配修复(mismatch repair, MMR)蛋白功能缺失在结直肠癌的风险评估、诊断和预后判断中的意义已多有报道，其与85%的遗传性非息肉病性结直肠癌(Lynch综合征)及15%的散发性结直肠癌相关，具有重要的临床意义，而RAS(KRAS和NRAS)突变状态与临床病理特征的相关性尚存争议。本文着重探讨4种MMR蛋白(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)表达以及RAS(KRAS/NRAS)突变状态与结直肠癌临床病理特征的关系及应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2016年1月～2019年11月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院诊治的186例结直肠癌患者，其中男性109例，女性77例；年龄20～88岁(64.54±11.21岁)；结肠癌96例，直肠癌90例。所有病例的病理切片均经两位资深病理医师重新复诊，包括复阅HE切片和诊断，统计肿瘤的组织学类型、发生部位、分化程度及肿瘤分期等临床病理特征。按WHO(2019)消化系统肿瘤分类标准进行分类，依据国际抗癌联盟(UICC)第8版肿瘤TNM分期系统进行肿瘤分期。纳入标准：术前未行放、化疗和抗肿瘤药物治疗；临床病理资料均完整。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片，HE染色。使用DAKO公司Link48型自动免疫组化仪进行免疫组化EnVision两步法染色。MSH2、MSH6、MLH1和PMS2抗体均购自广州安必平公司。每批染色均设立已知阳性对照，并用PBS代替一抗作为阴性对照。MSH2、MSH6、MLH1及PMS2阳性均定位于细胞核。肿瘤周围的正常上皮细胞、肿瘤内浸润的淋巴细胞、间质细胞出现细胞核阳性着色可作为内对照。判读标准为所有肿瘤细胞核无阳性着色判定为该蛋白表达缺失，任何程度和比例细胞核着色均判定为蛋白表达存在。将4种MMR蛋白均阳性判定为错配修复基因完整(proficient mismatch repair, pMMR)组，将4种MMR蛋白中的1种及以上表达缺失判定为错配修复基因缺失(deficient mismatch repair, dMMR)组。

1.2.2突变扩增阻滞系统聚合酶链反应法(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction, ARMS-PCR) 结直肠癌手术切除标本石蜡包埋，5 μm厚连续切片10张，刮取肿瘤组织至1.5 mL灭菌EP管中备用。使用ARMS-PCR法(厦门艾德公司)检测KRAS、NRAS基因2、3和4号外显子突变。

1.3 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。MMR蛋白表达、RAS基因突变状态与结直肠癌临床病理特征的差异进行χ2检验、校正χ2检验或Fisher精确检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌中4种MMR蛋白的表达免疫组化结果显示，186例结直肠癌中MMR蛋白表达缺失dMMR组13例，MMR蛋白表达pMMR组173例，缺失率达6.99%，其中MSH2和MSH6共同缺失2例(图1)；MLH1和PMS2共同缺失9例；MSH6单独缺失1例；PMS2单独缺失1例。

2.2 MMR蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系MMR蛋白表达缺失与结直肠癌患者发病年龄、肿瘤发病部位、是否伴有黏液腺癌成分、分化程度和临床分期等有相关性(P<0.05)，表现为dMMR患者大多发病年龄低(<50岁)、肿瘤部位多为右半结肠、伴有黏液腺癌、肿瘤低分化、肿瘤分期早(大多为Ⅰ+Ⅱ期)，与患者性别无相关性(P>0.05，表1)。

图1 A.结肠癌细胞核中MSH2呈阴性，EnVision两步法；B.结肠癌细胞核中MSH6呈阴性，EnVision两步法；C.结肠癌细胞核中MLH1呈阳性，EnVision两步法；D.结肠癌细胞核中PMS2呈阳性，EnVision两步法

2.3 RAS基因突变与结直肠癌临床病理特征的关系186例结直肠癌组织中RAS基因突变者97例(52.15%)，其中KRAS突变88例(47.31%)：2号外显子突变74例(84.09%)，3号和4号外显子突变各7例(7.95%)；NRAS突变9例(4.84%)：2号外显子突变6例(66.66%)，3号外显子突变3例(33.33%)，4号外显子突变未检出。χ2检验显示，186例结直肠癌患者RAS基因突变与患者性别、年龄、肿瘤部位、是否伴黏液腺癌成分、肿瘤分化及肿瘤分期等均无相关性(P>0.05，表1)。

表1 MMR蛋白表达及RAS基因突变与结直肠癌临床病理特征的相关性[n(%)]

2.4 不同MMR-RAS基因状态及与结直肠癌临床病理特征的关系本组13例dMMR病例检出dMMR-RAS突变型4例(30.8%)，其中KRAS突变3例(2例为2号外显子突变，1例为4号外显子突变)，NRAS突变1例(2号外显子突变)。4例中3例为女性，3例年龄<50岁，年龄最小者20岁，3例位于右半结肠，4例均无黏液腺癌成分且均有低分化成分，3例肿瘤分期为Ⅱ期，1例为Ⅳ期；dMMR-RAS野生型9例(69.2%)，其中5例为女性，仅1例年龄<50岁，8例位于右半结肠，8例伴有不同程度黏液腺癌成分，5例有低分化成分，7例肿瘤分期为Ⅱ期，2例为Ⅳ期。dMMR-RAS突变组与dMMR-RAS野生组相比，两者在是否有黏液腺癌上差异有显著性(P<0.05)，在患者性别、发病年龄、肿瘤部位、肿瘤分化及肿瘤分期方面差异均无显著性(P>0.05，表2)。

本组173例pMMR病例中检出RAS突变型93例(53.8%)，其中KRAS突变85例(2号外显子突变72例，3号外显子突变7例，4号外显子突变6例)，NRAS突变8例(2号外显子突变5例，3号外显子突变3例)。pMMR-RAS突变组与pMMR-RAS野生组在患者性别、发病年龄、肿瘤部位、是否伴黏液腺癌、肿瘤分化及肿瘤分期方面差异均无显著性(P>0.05，表2)。

3 讨论

随着分子生物学的发展，研究者们发现MMR蛋白表达和RAS突变等分子标志物与结直肠癌临床病理学特征、生物学行为、治疗及预后等密切相关。NCCN指南推荐对于所有新诊断为结直肠癌的患者均进行MMR或微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)的常规检测，这不仅可为新发结直肠癌患者筛查Lynch综合征提供参考，还可提示Ⅱ期高微卫星不稳定(high microsatellite instability，MSI-H)结直肠癌患者预后良好，不能从5-FU单药辅助化疗中获益，但能够从抗PD-1免疫治疗中获益[2-3]。研究表明MMR状态是评估结直肠癌的重要分子标志物，dMMR结直肠癌的临床病理特征包括好发于年轻患者、右半结肠、常见于低分化及早期肿瘤，dMMR结直肠癌患者具有良好的预后和治疗反应。Guo等[4]对结直肠癌临床Ⅰ～Ⅳ期1 834个样本进行回顾性分析，发现dMMR与临床Ⅲ期结直肠癌患者较长的生存期独立相关。本组实验检测186例结直肠癌组织中的MMR蛋白表达，发现MMR蛋白总缺失率为6.99%，接近于Guo等报道的6.7%。结合患者的临床病理资料进行统计分析，发现dMMR患者好发于50岁以下年轻患者、肿瘤部位多为右半结肠、伴有黏液腺癌和肿瘤低分化、肿瘤分期早(Ⅰ+Ⅱ期)的患者，与患者性别无关，这与上述结果基本一致。

表2 dMMR与pMMR中RAS基因突变与结直肠癌临床病理特征的相关性[n(%)]

目前RAS突变已成为潜在的肿瘤标志物以及精准治疗的靶点，具有重要的临床意义[5-7]。RAS突变可以预测抗EGFR治疗耐药，已经成为转移性结直肠癌抗EGFR治疗前筛查的必要项目。NCCN指南也建议结直肠癌患者在接受西妥昔单抗和帕尼单抗治疗前需进行扩展的RAS基因(包括KRAS和NRAS)检测，以尽可能检测出潜在的基因突变，保证靶向药物的合理应用。国内外研究结果显示[8]，27%～56%结直肠癌患者伴KRAS基因突变，1%～7%伴NRAS基因突变。本组实验中RAS基因突变率为52.15%，其中KRAS突变率为47.31%，主要发生于2号外显子，NRAS突变率为4.84%，与上述报道数据基本一致。关于RAS突变与临床病理特征的关系目前尚不清楚，有研究指出结直肠癌中RAS突变与患者性别、组织学类型、分化程度、微卫星稳定表型等临床病理特征有关[4,9]；也有文献[10]报道，RAS突变与患者性别、组织学类型、分化程度、TNM分期等均无关，但与患者年龄有关。Zhang等[11]发现RAS不同突变亚型的临床病理特征存在差异，KRAS突变与伴有黏液腺癌和肿瘤分期早显著相关，而NRAS突变则与临床病理特征均无相关性，两种突变可能是彼此独立的影响着结直肠癌的进程；而对KRAS野生型患者进行NRAS突变检测，将有助解释抗EGFR单克隆抗体治疗的抗药性。文献报道1 735例结直肠癌患者的RAS状态与临床病理特征进行分析，发现KRAS突变更多见于男性、分化较好的普通型腺癌以及微卫星稳定表型，而NRAS突变与临床病理特征无相关性[8]。本实验发现RAS突变与患者年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度、TNM分期等均无相关性，不同研究结果的差异可能与样本量大小、种族、地域、不同检测方法及判读标准等因素有关。另有研究发现dMMR-RAS突变肿瘤常见于右半结肠，且多表现为黏液腺癌。本组实验分析dMMR患者的RAS状态，发现dMMR病例中RAS突变率(30.8%)低于pMMR病例中RAS突变率(53.78%)，dMMR病例中RAS基因突变状态与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、TNM分期等均无相关性，但与是否伴有黏液腺癌成分有显著相关性，dMMR-RAS突变型病例均不伴有黏液腺癌成分，而dMMR-RAS野生型病例多伴黏液腺癌成分，这一结果与上述研究有较大差异，可能由于本组dMMR病例数较少，存在统计偏倚，后续将进一步进行大样本验证和分析。Zhang等[11]报道KRAS突变在dMMR肿瘤中常见，dMMR肿瘤中KRAS突变与临床病理特征未发现相关性，且在临床Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者中也未发现KRAS突变的预后因子。有研究发现dMMR-KRAS突变患者的5年肿瘤特异性生存率为76%，低于dMMR-KRAS野生组的93%，提示dMMR-KRAS突变患者预后更差。联合检测MMR和RAS状态或可有助于结直肠癌的分子分型、预后判断，并提供更明确的后续用药指导。

综上所述，本组实验发现MMR蛋白表达和RAS基因突变与结直肠癌临床病理特征有关，检测结直肠癌组织中MMR蛋白表达和RAS基因突变状态，有助于制定术后诊疗方案和预后判断，并可根据检测情况给予更精准的靶向治疗，提高个体化诊疗水平。