乙型肝炎患者血清丝氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1表达与病毒载量的相关性分析

刘宏伟 王玉华

1.河北省沧州市传染病医院肝病科 (河北 沧州， 061001) 2.河北省沧州市人民医院检验科

乙型肝炎病毒(HBV)感染属于全球传染性疾病，严重威胁人类健康[1]。HBV持续感染则会导致肝硬化，此外细胞内HBV复制所造成的病理损伤也是引发肝硬化的重要分子机制，乙型肝炎患者血清中HBV DNA载量能够反映患者病毒感染程度[2,3]。丝氨酸肽酶抑制因子 Kazal 1 型(SPINK1)属于炎性蛋白，主要分布于肝脏。Lamontagne等[4]研究发现肝癌患者组织中及乙型肝炎病毒携带者血清中SPINK1表达水平明显升高，推测其可能参与肝癌的发展过程。本研究分析SPINK1水平与乙型肝炎患者HBV DNA载量的关系，为乙型肝炎的发病机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年4月至2019年4月在河北省沧州市传染病医院接受治疗的157例乙型肝炎患者资料，其中男99例，女58例；年龄23～69岁，平均(47.36±11.32)岁。另选取近期在该院体检的126例健康者作为对照组，男82例，女44例；年龄22～68岁，平均(45.51±12.27)岁。两组受试者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①所有乙型肝炎患者均符合 《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准[5]；②对照组人群肝功能正常；③年龄<70岁；④所有受试者知情同意。排除标准：①合并自身免疫疾病者；②酒精等其他因素导致的肝炎患者；③未接受抗病毒相关治疗者；④近期服用降酶药物或免疫抑制剂者；⑤复合病毒感染者。

1.3 研究方法

1.3.1 样本采集 入院时收集所有受试者空腹外周血5 ml，加入抗凝剂后，3 000g离心20 min分离血清，在-80℃中冻存。

1.3.2 主要试剂和仪器 RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司，货号:15596018。RNA逆转录试剂盒购于Thermo Fisher Scientific公司，货号：K1622。qPCR反应试剂盒购于艾美捷科技有限公司，货号P-1029-100。DNA提取试剂盒购于美国Omega公司，货号：M6229-01。HBV DNA检测试剂盒购于ROCHE公司，货号11585614910。人HBsAg酶联免疫吸附剂测定(ELISA)试剂盒购于上海恒斐生物科技有限公司，货号:CSB-E10089h-1。抗HBs ELISA试剂盒购于上海羽朵生物科技有限公司，货号:YDBA042。 HBeAg ELISA试剂盒购于武汉菲恩生物科技有限公司 ，货号:EH4105。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)检测试剂盒购于上海晶抗生物工程有限公司，货号分别为3185、2349、108226、14867。7500 PCR仪购于美国ABI公司。酶标仪购于北京安麦格贸易有限公司。

1.3.3 RT-PCR法检测血清中SPINK1 mRNA表达 采用Trizol试剂提取血清总RNA，根据RNA逆转录试剂盒将RNA反转录cDNA，SPINK1 引物序列:上游:5′-TAACAGGCATCTTTCTTCT-3′，下游:5′- AGTATTTCCATCAGTCCC -3′；GADPH引物序列：GAPDH上游引物：5′-CAAGTTCAACGGCAGTCA-3′; 下游引物:5′-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3′。20 μl扩增体系：10 μl SYBR Mastermix ，上下游引物分别0.5 μl、2 μl cDNA，ddH2O 7 μl。反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，60℃退火30 s，40个循环。每个样本设定3个重复，结束后将GAPDH为内参基因，根据2-ΔΔCq算法定量评估SPINK1相对表达量。

1.3.4 RT-PCR法检测血清HBV-DNA载量 参考DNA提取试剂盒说明提取血清DNA，配制40 μl扩增体系： 20 μl PCR Mix，2 μl 引物混合物，DNA样品2 μl(样品/阴性质控品/阳性质控品)，ddH2O 16 μl。混匀后，程序参数设置为93℃ 2 min，1个循环；93℃ 45 s ，55℃ 1 min，10个循环；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30个循环，于55℃ 45 s时采集荧光。

1.3.5 血清抗原标志物、肝功能检测 采用ELISA法对所有受试者血清中HBsAg、抗HBs、HBeAg、ALT、AST、TBil、DBil水平，具体参考试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 两组受试者血清SPINK1表达水平 乙型肝炎组患者血清中SPINK1 mRNA水平为1.78±0.26，与对照组(1.05±0.12)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 乙型肝炎患者血清SPINK1表达与HBV DNA载量的关系 乙型肝炎患者血清HBV DNA载量为(5.34,12.45)log10 copies/ml，中位值为7.81 log10 copies/ml。以HBV DNA病毒载量<7.81 log10 copies/ml为低载量组，以HBV DNA病毒载量>7.81 log10 copies/ml为高载量组。高载量组患者血清中SPINK1 mRNA表达为2.06±0.33，与低载量组(1.57±0.46)比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 血清抗原标志物与HBV DNA载量的关系 与低载量组比较，高载量组患者血清HBsAg、HBeAg水平明显升高，HBcAb水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同HBV DNA载量组患者HBsAg、HBeAg、HBcAb水平比较

2.4 乙型肝炎患者肝功能指标与HBV DNA载量的关系 与低载量组比较，高载量组患者血清ALT水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者AST、TBil、DBil水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同HBV DNA载量组ALT、AST、TBil、DBil水平比较

2.5 影响乙型肝炎患者HBV DNA载量的Logistic回归分析 以乙型肝炎患者HBV DNA载量作为因变量，HBsAg、HBcAb、HBeAg、ALT、SPINK1作为自变量纳入Logistic回归分析。结果显示，HBeAg(OR=1.586，95%CI=1.028～2.446)、ALT(OR=1.965，95%CI=1.307～2.954)、SPINK1(OR=1.842，95%CI=1.167～2.908)是乙型肝炎患者HBV DNA载量危险影响因素。见表3。

表3 影响乙型肝炎患者HBV DNA载量的因素

2.6 SPINK1与HBV DNA载量、血清抗原标志物、肝功能相关性分析 Pearson相关性分析显示，SPINK1与HBV DNA载量、HBeAg、ALT呈正相关，差异均有统计学意义(r=0.426，r=0.408，r=0.395，均P<0.05)。见图1。

图1 SPINK1与HBV DNA载量、HbeAg、ALT相关性

3 讨论

乙型肝炎的病理机制是HBV进入体内后不断复制，引起病毒血症，同时HBV复制可干扰肝细胞内大分子的合成，降低溶酶体膜通透性降低，引发肝脏病变[6]。HBV感染初期患者一般无明显特征，少部分患者会自发清除病毒，但多数患者HBV感染是持续性的，可进一步发展为慢性乙型肝炎，甚至转变为肝硬化、肝癌。研究发现，乙型肝炎表面抗原、炎症因子、白细胞介素等均与HBV感染相关，可能影响肝脏功能，进而影响HBV感染的不同结局，深入探究影响HBV DNA载量的分子机制，对于揭示肝炎、肝癌的发生机制具有重要的意义[7,8]。

SPINK1属于胰蛋白酶抑制剂，定位在染色体5q32位置，其水平的异常表达与肿瘤的异常发生相关[9]。Faisal等[10]研究发现在前列腺患者组织中SPINK表达显著升高，进一步分析发现与肿瘤浸润程度、患者预后无明显关系。Xu等[11]研究发现SPINK1能够促进肺腺癌细胞的侵袭、迁移，其机制可能与上调基质金属酶12表达有关，预后分析发现SPINK1高表达是患者预后不良的独立因素。Shek等[12]研究发现发现SPINK1在人肝癌中高表达，体外实验发现spink1通过激活c-raf/mek/erk途径促进肿瘤细胞的增殖、侵袭。王伟等[13]研究发现肝癌患者血清中SPINK1表达明显升高，对肝癌具有较高的诊断效能，高水平SPINK1表达者生存期明显低于低水平表达者。目前HBV对SPINK1的作用研究不多，国内学者研究发现丙型肝炎患者血清中SPINK1表达显著升高，体外研究发现HCV可上调肝癌细胞中SPINK1表达[14]。本研究发现乙型肝炎患者血清中SPINK1表达明显升高，进一步分析发现随着HBV DNA载量的增加，乙型肝炎血清中SPINK1表达进一步升高，Pearson相关性分析发现两者呈显著正相关，提示SPINK1可能参与乙肝病毒感染过程，与感染程度有关。Logistic回归分析发现SPINK1是影响患者HBV DNA载量的危险因素，提示高水平SPINK1可能会增加HBV感染风险。

研究发现HBsAg主要用于HBV感染初期筛查和诊断，可用于病毒治疗效果评定[15]。HBeAg阳性可作为HBV复制的标志 ，其水平的升高代表传染性、致病性较强， 当 HBeAg水平降低，则表明HBV复制减少，病情相对稳定[16]。本研究发现高载量组患者血清HBsAg、HBeAg水平明显升高，HBcAb水平明显降低，说明随着病毒复制增多，血清HBsAg、HBeAg水平升高，HBcAb水平降低，三者与HBV感染程度相关。Logistic分析发现HBeAg是影响患者HBV DNA载量的影响因素，说明HBsAg、HBcAb水平的变化可能不能直接反映HBV DNA载量情况，而病毒处于复制状态时，HBV DNA载量处于较高水平，提示HBeAg水平可反映患者HBV DNA载量。Logistic回归分析发现HBeAg是影响患者HBV DNA载量的影响因素，说明高水平的HBeAg会进一步影响患者HBV DNA载量。SPINK1、HBeAg均与患者HBV DNA载量相关，进一步采用Pearson相关性分析两者间的关系发现两者呈显著正相关，说明二者可能存在某种相互作用共同参与患者HBV的复制，具体机制尚不明确。

HBV DNA载量是否与肝脏损伤有关，观点不一，相关学者研究发现血清HBV DNA定量与肝脏炎症因子及功能指标无明显相关性[17]；有学者研究认为 HBV DNA载量升高会进一步加重肝脏炎症损伤，加重感染程度[18]。本研究发现，随着HBV DNA载量的升高，肝功能相关指标ALT水平升高，表明随着病毒载量的升高，肝脏受损程度加重，提示病毒复制可能会影响肝功能。Logistic回归分析发现ALT是影响患者HBV DNA载量的影响因素，说明肝功能受损后会进一步影响患者HBV DNA载量。SPINK1、ALT均与患者HBV DNA载量相关，采用Pearson相关性分析SPINK1、ALT间的关系，发现两者呈显著正相关，推测SPINK1上调后会加速病毒复制，进一步损伤肝功能，影响ALT水平。