正交试验法优化南非叶抑菌活性成分提取工艺

黄敏桃 庞小莉 杨林芳 谭丽凤 薛娟萍 廖显辉 黄庶识

摘 要 利用正交试验法，以南非叶对金黄色葡萄球菌的抑菌活性为指标，采用超声波提取法对南非叶提取工艺进行优化。在单因素试验基础上，选择试验因素和水平，设计正交试验考察南非叶抑菌活性成分最佳提取工艺。结果表明，最佳提取工艺为：95%乙醇超声提取2次，提取时间60 min，液料比30∶1（体积与重量比）。在此条件下提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达18.08 mm。

关键词 南非叶;抑菌;活性成分;提取工艺;正交试验法

中图分类号：Q503 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.34.018

南非叶为菊科斑鸠菊属植物扁桃斑鸠菊（Vernonia amygdalina Del.）的叶。扁桃斑鸠菊别名桃叶斑鸠菊、神奇叶、苦树、苦胆叶、苦茶叶、南非树等[1]，原产于热带非洲，在尼日利亚等地被当作一种蔬菜[2]，尤以东南亚和台湾等地民间应用较多，已在药品、食品工业等领域得到应用。南非叶味苦涩，性凉，具有抗肿瘤、抗氧化、清热解毒、散热凉血、降血压、降胆固醇和降血糖等多种功效[3-5]，适用于高血压、高胆固醇、糖尿病的治疗。南非叶的水煎剂具有促胃酸分泌、降血脂、抗疟原虫和抗癌作用[6]。东南亚民间常用南非叶治疗乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌等多种癌症[7-8]。因此，南非叶以抗癌草药著称。

前人研究表明，南非叶的热乙醇或冷乙醇提取物可以抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌的生长[9]，表明南非叶具有较强的抗菌活性。南非叶在我国广东、广西、福建等地均有引进种植，是民间常用中药，但是相关文献还未见涉及其抑菌活性研究。笔者以广西南非叶为研究对象，采用对金黄色葡萄球菌的抑菌效果作为指标，在单因素试验的基础上，应用正交试验法对南非叶提取工艺进行优化研究，为后续南非叶品质研究提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  试剂与材料

1.1.1  药材与试剂

药材：南非叶购于广西玉林中药材专业市场。

试剂：石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇（均为分析纯，天津大茂化学试剂厂生产），纯化水。

1.1.2  细菌

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach ）（ATCC26003）购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）。

1.1.3  培养基

琼脂培养基、营养肉汤（广东环凯公司生产）。

1.2  设备

电子天平（浙江永康市五鑫衡器有限公司），数显恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），索氏提取器（上海精学科学仪器有限公司），数显电热培养箱（上海博迅实业有限公司），牛津杯（天津思利达公司），0.22 μm微孔滤膜（天津津腾公司），超净工作台（苏州净化设备厂），智能型超声波清洗机（福州德森精工有限公司）。

1.3  试验方法

1.3.1  不同溶剂提取试验

称取5 g南非叶粉末6份，分别加入石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇、纯化水各150 mL，超声波提取60 min，提取2次，过滤浓缩挥干，挥干物用甲醇定容至10 mL容量瓶备用。重复3次。

1.3.2  提取方法试验

称取5 g南非叶粉末3份，各加入95%乙醇150 mL，一份超声波提取2 h，一份常温浸泡24 h，一份于95 ℃索氏回流提取2 h，过滤浓缩挥干，挥干物用甲醇定容至10 mL容量瓶备用。重复3次。

1.3.3  提取功率试验

称取5 g南非叶粉末2份，各加入95%乙醇150 mL，分别选择20、40 kHz两个超声功率提取60 min，提取2次，过滤浓缩挥干，挥干物用甲醇定容至10 mL容量瓶备用。重复3次。

1.3.4  液料比试验

称取5 g南非叶粉末6份，分别加入50、100、150、200、250、300 mL的95%乙醇溶剂，20 kHz超声波提取1 h，提取2次，過滤浓缩挥干，挥干物用甲醇定容至10 mL容量瓶备用。重复3次。

1.3.5  提取时间试验

称取5 g南非叶粉末5份，各加入150 mL的95%乙醇溶剂，20 kHz超声波分别提取30、40、50、60、70 min，提取2次，过滤浓缩挥干，挥干物用甲醇定容至10 mL容量瓶备用。重复3次。

1.3.6  提取次数试验

称取5 g南非叶粉末4份，各加入150 mL的95%乙醇溶剂，20 kHz超声波分别提取1、2、3、4次，过滤浓缩挥干，挥干物用甲醇定容至10 mL容量瓶备用。重复3次。

1.3.7  杯碟法测定样品对细菌生长的抑制作用

将金黄色葡萄球菌接种至营养肉汤，35 ℃恒温培养15～18 h至生长对数期，用无菌生理盐水稀释10倍，将稀释后的菌液吸取50 ?L均匀涂布在琼脂平板表面，稍干后将牛津杯等距离放置琼脂表面，一个平板放置3个牛津杯，每个牛津杯定量加入200 ?L无菌过滤后的南非叶提取液，4 ℃冰箱放置10 h使药液扩散，再移到35 ℃恒温箱继续培养18～20 h，观察并测量抑菌圈直径。每个药液样品试验重复3次，其平均值为抑菌结果。

1.3.8  正交试验法对提取工艺的优化

综合各单因素试验结果设计正交试验条件，以南非叶抑菌圈为指标，提取时间（50 min、60 min、70 min），液料比（20∶1、30∶1、40∶1，皆为体积与重量比，下同），提取次数（1次、2次、3次）为考察对象（见表1），重复试验3次。

2  结果与分析

2.1  单因素试验

2.1.1  不同溶剂提取试验

试验表明，石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇和水六个处理的抑菌圈直径分别为6、13.62、12.72、13.29、6、6 mm，可见石油醚、甲醇、水这3种试剂对金黄色葡萄球菌无明显对抑菌作用，正丁醇、95%乙醇提取物抑菌效果最好，其次为乙酸乙酯提取物。从试剂安全性及经济方面综合考虑，95%乙醇作为提取溶剂，既能达到最佳抑菌效果，且安全无污染，节约成本，因此，最后选择95%乙醇作为提取溶剂，与Ogbulie J N等[9]研究结果一致。

2.1.2  提取方法试验

通过超声波、冷浸、索氏回流3种方法提取的提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用差异较大，回流提取与超声波提取时间均为2 h，冷浸时间较长，抑菌效果顺序为超声波（13.29 mm）>索氏回流（9.73 mm）>冷浸（6 mm）。可能的原因是，超声波在快速振荡情况下，其空化作用对细胞膜起到破坏从而有助于有效成分溶出释放，避免有效成分因受热引起破坏。而回流提取通过加热促使有效成分溶出，因此比冷浸提取抑菌效果好，但是可能由于温度过高，部分成分被破坏，抑菌效果整体比超声波低。超声波提取法作为常见的一种提取方法，操作简便，成本较低。前人研究表明，超声波对南非叶总黄酮、多酚等成分具有良好的提取效果[10-11]，而总黄酮类化合物具有明显抑菌作用。因此，后续的南非叶提取方法研究选择超声波提取法。

2.1.3  提取功率试验

20 kHz条件下南非叶提取物抑菌活性较好，40 kHz情况下也具有抑菌效果，20 kHz、40 kHz功率的抑菌圈直径分别为15.15、13.31 mm。超声波功率越高，在提取过程中会不断产生热量，温度提高，可能对部分成分产生破坏，影响效果。因此选择提取功率为20 kHz。

2.1.4  液料比试验

由图1可知，液料比30∶1的提取效率最高，抑菌圈达到17.53 mm。95%乙醇量继续增加，反而抑菌效果减弱，可能存在试验误差等客观因素。综合考虑节约溶剂等，采用30∶1的液料比进行优化试验。

2.1.5  提取时间试验

由图2可知，随着时间增加，整体上南非叶提取物抑菌活性增强，在40 min时有下降趋势，可能存在试验误差，50～70 min时间内呈缓慢上升趋势，三个时间段抑菌效果相差不明显，抑菌圈直径相差仅约0.3 mm，结合相关南非叶提取时间约60 min研究结果 [11]，考虑节约时间成本，认为提取时间为60 min较合适。

2.1.6  提取次数试验

试验表明，提取次数1、2、3、4次的抑菌圈直径分别为14.69、17.52、17.68、17.58 mm。综合考虑成本等因素，以提取2次的抑菌效果最好，提取次数增加，抑菌效果增加不明显。因此，采用提取2次进行试验优化。

2.2  正交试验

表2结果显示，对南非叶提取物抑菌效果的影响顺序为提取时间（A）>液料比（B）>提取次数（C）。方差分析结果（见表3）表明，提取时间影响效果更加显著，另外两个因素影响相对较小。根据正交试验结果，确定A2B2C2为最佳提取条件，即提取时间60 min，液料比30∶1，提取次数2次。

2.3  验证试验

采用超声波提取法，以95%乙醇为提取溶剂，提取时间60 min，液料比30∶1，提取2次，此条件下进行试验验证（见表4）。结果表明，正交试验法优化得到的南非叶提取物对金黄色葡萄球菌抑菌效果稳定。

3  结论与讨论

超声波提取方法简便、耗时短、效率高，能够使南非叶粉末在高频率振荡过程中充分溶解出有效活性成分，同时避免因高温加热而引起部分活性成分被破坏失效等问题，是一种理想的常用提取方法。根据研究结果，南非叶提取物对金黄色葡萄球菌抑菌活性成分最佳提取工艺为：95%乙醇超声波提取2次，提取时间60 min，液料比30∶1（体积与重量比），在此条件下抑菌圈直径为18.08 mm，RSD值为0.64%，说明提取工艺条件稳定、可行，可为后续进一步研究提供参考。

参考文献：

[1] 管磬馨，胡文忠，张 越，等.南非叶活性成分及抗癌功效的研究进展A].中国食品科学技术学会第十六届年会暨第十届中美食品业高层论坛摘要集[C]，武漢，2019：243-244.

[2] Tonukari NJ，Avwioroko OJ，Ezedom T，et al. Effect of Preservation on Two Different Varieties of Vernonia amygdalina Del.（Bitter） Leaves[J]. Food and Nutrition Sciences，2015（7）：633-642.

[3] 张梅坤.南非叶扦插繁殖技术试验[J].防护林科技，2015（8）：33-35.

[4] 杨早.南非叶化学成分及药理作用研究进展[J].南京中医药大学学报，2013（4）：397-400.

[5] Sani AA，Alemika ET，Abdulraheem RO，et a1. A study review of documented phytochemistry of Vernonia amygdalina（family Asteraceae） as the basis for pharmacologic activity of plant extract[J]. Journal of Natural Sciences Research，2012（7）：1-8.

[6] 章健.辛温与苦寒药配伍规律初探[J].安徽中医学院学报，1988，7（3）：43-45

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[8] 李盛青，黄兆胜，刘明平.五味与五脏归经关系探讨[J].中医研究，2010，10（5）：5-7.

[9] Ogbulie JN，Ogueke CC，Nwanebu FC. Antibacterial properties of Uvaria chamae， Congronema latifolium， Garcinia kola， Vemonia amygdalina and Aframomium melegueta[J]. African Journal of Biotechnology，2007，6（13）：1549-1553.

[10] 陈文娟，韩颖，陈建福.超声波辅助法提取南非叶多酚的工艺研究[J].云南民族大学学报（自然科学版），2020，29（5）：423-429.

[11] 雷燕妮，张小斌，陈书存，等.南非叶中总黄酮提取工艺的优化[J].陕西农业科学，2021，67（4）：54-57，62.

（责任编辑：丁志祥）

收稿日期：2021-08-12

基金项目：广西高校中青年教师基础能力提升项目（2019KY1415）;广西教育厅科技项目“广西职业教育林业技术专业（群）发展研究基地”（桂教职成〔2019〕63号）;广西科学研究与技术开发计划（0992003A-20）。

作者简介：黄敏桃（1987—），女，广西南宁人，硕士，讲师，主要从事中药质量控制研究。E-mail：897353853@qq.com。

*为通信作者，E-mail：hshushi@gxas.cn。