高迁移率族蛋白B1介导大鼠创伤性脑损伤后小胶质细胞M1极化和神经炎症

林维斌，陈祥荣，曾以勒，徐朝阳，陈峻严

（福建医科大学附属第二医院神经外科，泉州 362000）

小胶质细胞在创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）后继发病理生理过程中发挥着神经损伤与保护双重作用，而这一双重作用与活化的小胶质细胞亚型密切相关[1]。根据分泌细胞因子的不同，活化的小胶质细胞可分为致炎的M1型和抑炎的M2型[1]。促使小胶质细胞 M1向 M2亚型极化，有效抑制TBI后小胶质细胞介导的早期炎症反应，可改善伤后神经功能[2‐5]。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种重要的炎性介质，其可通过去乙酰化调控小胶质细胞极化，在神经炎症反应中发挥极为重要的作用[6‐8]。进一步深入探讨HMGB1通路调控小胶质细胞极化对TBI后神经炎症反应的影响，有助于为TBI后继发性颅脑损伤的治疗寻找可能的干预靶点。甘草酸是常用的HMGB1拮抗剂，其可通过直接结合HMGB1抑制其活性和释放，降低HMGB1表达发挥抗炎作用[9]。本研究拟利用大鼠TBI模型，选用甘草酸作为拮抗剂探讨HMGB1通路对大鼠创伤性脑损伤后神经炎症的影响。

材料与方法

1 实验材料

HMGB1、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）购置于美国CST公司；核转录因子‐κB（NF‐kB）、离子钙结合适配器分子‐1（Iba‐1）、CD16、CD206购置于美国Abcam公司；TNF‐α、IL‐1β，IL‐6和IFN‐γ购置于美国Signalway Antibody公司；HMGB1拮抗剂甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）购置于美国Sigma公司。

2 实验动物与分组

成年健康雄性清洁级SD大鼠购置于福建医科大学动物实验中心，共96只，体重250 g左右，根据实验要求，利用随机数字表法分为假手术组（Sham）、脑损伤组（TBI）、脑损伤+溶剂组（TBI+Vehicle）、脑损伤+ HMGB1拮抗剂组（TBI+GL），按模型制作后第1、3、7、14 d 4个时间点设4个亚组，每亚组均为6只。该实验经福建医科大学实验动物伦理委员会批准并在其监督下执行。

3 TBI模型建立及动物处理

根据既往实验模型制作[10‐12]，TBI大鼠模型采用Feeney自由落体撞击法：戊巴比妥钠腹腔麻醉(45 mg/kg)后，右侧冠状缝后2 mm、旁中线2 mm处作为打击部位，刀片切开头皮至骨面，高速磨钻磨出直径5 mm的骨孔，注意误穿破硬膜，取30 g重的击锤至20 cm高处自由坠落冲击撞杆致大鼠中型颅脑损伤，棉球压迫止血，骨蜡封闭骨孔，缝合头皮。Sham组大鼠仅开骨窗不予撞击。TBI+GL组大鼠于模型建立后30 min腹腔注射GL（剂量50 mg/kg），每日一次，连续干预3 d。其余各组同一时间也给予等剂量溶剂二甲基亚砜注射。

4 神经功能损伤的评定

采用改良神经功能评分表（modified neurological severity scores, mNSS）对大鼠伤后第1、3、7、14 d神经功能进行评价[12]，综合评价大鼠运动（肌肉状态、异常动作）、感觉（视觉、触觉、平衡觉）和反射反应。当大鼠无法正确完成某项指令动作或所测试的反射消失时即为阳性结果。测试得分越高代表神经功能损伤程度越重。

5 Nissl染色检测神经元凋亡

标本组织取自脑挫裂伤灶边缘约2 mm脑挫伤皮质，甲醛固定后以石蜡包埋，5 μm切片后经二甲苯脱蜡，无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、蒸馏水梯度水化，柠檬酸缓冲液煮沸法修复抗原。常温下尼氏染色液染色10 min，蒸馏水冲洗后95%酒精脱水，二甲苯处理后封片。细胞调亡阳性：细胞胞体缩小、形状不规则、呈斑驳的蓝紫色。采取双盲法方法计数，在光学显微镜（20物镜）下观察脑损伤灶周围调亡神经元，随机选取5个视野，计数神经元凋亡率用于统计分析。

6 免疫荧光染色

标本组织取自脑挫裂伤灶边缘约2 mm脑挫伤皮质，甲醛固定后以石蜡包埋，5 μm切片后经二甲苯脱蜡，无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、蒸馏水梯度水化，柠檬酸缓冲液煮沸法修复抗原。羊血清封闭，滴入一抗Iba‐1抗体（1:100），CD16抗体（1:200），CD206抗体（1:200），置入保持潮湿的染色暗盒内，孵育过夜，PBS冲洗3遍，加1:100稀释的FITC标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗IgG，孵育30 min后，DAPI（1:3000）染核，封片，荧光显微镜（×200）观察染色结果，拍照。

7 酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测

在大鼠干预后各时间点，抽取鼠尾静脉血约10 ml，离心5 min（10 000 r/min，离心半径13.5 cm）取上清液。参照ELISA试剂盒检测流程测定TNF‐α、IL‐1β、IL‐6、IFN‐γ和HMGB1血清浓度。检测因子与单抗结合后，加入生物素化的抗大鼠抗体形成免疫复合物，测量OD值。参照标准品换算成相应浓度值，统一汇总表格并统计分析。

8 Western blot检测

取骨窗边缘约2 mm脑挫伤皮质置于‐4°冰上剪碎片后进行裂解，蛋白定量，煮沸变性，离心，提取上清液，‐20℃保存备用。提取蛋白量为25 µg，经SDS‐PSGE电泳分离蛋白,转至硝酸纤维素膜，于含100 g/L脱脂奶粉液中室温封闭2 h。加入一抗（抗IBa：1:1000；抗CD206：1:600；抗CD16：1:400；抗GAPDH：1:5000）置于4℃下过夜，加入HRP 偶联的山羊抗兔二抗室温孵育1 h，用 ECL 发光液显像，拍照，用Iamge Quant Las 4000 mini软件（GE公司，美国）分析测定条带光密度值，以目的蛋白条带与内参蛋白GAPDH条带光密度值的比值代表目的蛋白相对水平。

9 统计学方法

符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，应用SPSS20.0统计软件分析,单因素方差分析进行组间比较，进一步采用LSD‐t检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 特异性抑制HMGB1减少TBI后神经元凋亡和神经功能损伤

Nissl染色显示：正常神经元胞体形态结构正常，核仁清晰；凋亡神经元细胞胞体缩小、形状不规则、核固缩深染、呈斑驳的蓝紫色。TBI组各时间点神经元凋亡率比Sham组均明显升高；而TBI+GL组大鼠神经元凋亡率比TBI组显著降低（图1A、B）。

mNSS评分结果显示： TBI组各时间点mNSS评分比Sham组明显升高；而TBI+ GL组神经功能损害评分比TBI组明显下降，神经功能明显改善（图1C）。

图1 抑制HMGB1对TBI后神经元凋亡和神经功能的影响。A，抑制HMGB1对TBI后神经元凋亡的代表性Nissl染色检测（比例尺，50 μm）；B，神经元凋亡统计学分析。C，抑制HMGB1对TBI后神经功能影响的统计学分析。**P＜0.05；ns P＞0.05Fig.1 Effect of HMGB1 inhibition on neuronal apoptosis and neurological function after TBI in rat. A, representative Nissl staining result of the effect of HMGB1 inhibition on neuronal apoptosis after TBI (scale bar, 50 μm); B, statistical analysis of neuronal apoptosis rate; C, statistical analysis of effect of HMGB1 inhibition on neurological function after TBI; **P＜0.05; ns P＞0.05

2 抑制HMGB1减少大脑皮层损伤区域小胶质细胞上HMGB1表达

免疫荧光双染显示：相对于Sham组，TBI组皮层损伤区域Iba‐1阳性小胶质细胞上HMGB1阳性率明显增多；HMGB1特异性拮抗剂甘草酸干预后，相对于TBI组，TBI+GL组脑皮层损伤区域Iba‐1阳性小胶质细胞上HMGB1阳性率明显减少（图2）。

图2 抑制HMGB1对大鼠TBI后小胶质细胞HMGB1表达的影响。A，抑制HMGB1对小胶质细胞HMGB1表达影响的代表性免疫荧光双染图片；比例尺，50 μm。B，Iba‐1和HMGB1共表达小胶质细胞统计学分析；**P＜0.05；ns P＞0.05Fig. 2 Effect of HMGB1 inhibition on expression of HMGB1 in microglia after TBI. A, representative images of double immunofluorescent staining for the effect of HMGB1 inhibition on expression of HMGB1 in rat microglia; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of microglia with co‐expression of Iba‐1 and HMGB1; **P＜0.05; ns P＞0.05

3 抑制HMGB1促使小胶质细胞M1向M2亚型极化

免疫荧光双染结果显示：相对于Sham组，TBI组脑皮质CD16+ M1型小胶质细胞明显增多；与TBI组比较，TBI+GL组CD16+ M1型小胶质细胞减少，而CD206+ M2型小胶质细胞明显增多，即小胶质细胞由M1向M2亚型极化（图3A、B）。

Western blot检测同样显示：TBI组脑皮层Iba‐1、CD16水平比Sham组明显升高，TBI+GL组Iba‐1、CD16水平比TBI组明显降低，CD206水平显著升高（图3C、D）。

图3 HMGB1抑制对TBI后脑内小胶质细胞M1/M2亚型极化的影响。A，M1和M2型小胶质细胞的免疫荧光双染分析（比例尺，50 μm）；B，M1和M2型小胶质细胞比例的统计学分析。C，脑内Iba‐1、CD16和CD206水平的Western blot检测；D，Iba‐1、CD16和CD206水平的统计学分析。**P＜0.05；ns P＞0.05Fig.3 Effect of HMGB1 inhibition on the polarization of M1/M2 subtypes of microglia in rat brain after TBI. A, double immunofluorescent staining analysis of M1 and M2 subtypes of the microglia (scale bar, 50 μm); B, statistical analysis of M1 and M2 subtypes of the microglia; C, Western blotting detection for levels of Iba‐1, CD16 and CD206 in the brains; D, statistical analysis of levels of Iba‐1, CD16 and CD206; **P＜0.05; ns P＞0.05

4 抑制HMGB1减少大鼠TBI后炎症因子的水平

ELISA检测显示：与Sham组比较，TBI组伤后第3 d血清TNF‐α、IL‐1β，IL‐6和IFN‐γ水平升高；与TBI组比较，TBI+GL组伤后大鼠血清炎症因子水平明显下降（图4）。

图4 抑制HMGB1对大鼠TBI后血清炎症因子水平影响的ELISA检测。 **P＜0.05；ns P＞0.05Fig.4 ELISA detection for the effect of HMGB1 inhibi‐tion on levels of TBI‐induced inflammatory factors in rat sera. **P＜0.05; ns P＞0.05

讨 论

众所周知，TBI引起继发性损伤是包括氧化应激、炎症反应等多因素综合作用的结果。作为中枢神经系统固有免疫反应的主要介质，小胶质细胞在神经炎症中发挥重要作用。以往研究发现在TBI后，HMGB1作为重要炎性介质参与调控小胶质细胞极化及介导炎症的病理过程[7,8]，但作用机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨HMGB1与调控大鼠创伤性脑损伤后小胶质细胞极化及其神经炎症反应可能的作用机制，为颅脑损伤治疗靶点提供理论依据。研究结果显示：在TBI后HMGB1通路参与调控小胶质细胞极化及介导神经炎症的过程，特异性抑制HMGB1可减少脑损伤皮层小胶质细胞上HMGB1阳性表达，并促进小胶质细胞M1亚型向M2亚型极化,减轻神经炎症反应，进而改善伤后神经功能。机制可能与其调控小胶质细胞向M2亚型极化发挥抑炎作用有关。

HMGB1作为一种晚期重要炎性介质已被证实在炎症反应中发挥重要作用[6‐8]。甘草酸是常用的HMGB1拮抗剂，其原理是通过直接结合HMGB1抑制其活性和释放，降低HMGB1表达发挥抗炎作用[9]。本实验免疫荧光双染检测小胶质细胞标志物（Iba‐1+）及HMGB1表达的结果显示TBI大鼠脑损伤灶皮层Iba‐1染色阳性的小胶质细胞上HMGB1共表达的阳性率明显减少，表明药物特异性抑制可减少脑损伤伤皮层小胶质细胞上HMGB1阳性表达。由于小胶质细胞为脑内固有免疫细胞，故针对小胶质细胞上HMGB1表达的干预可作为未来治疗TBI后小胶质细胞介导的神经炎症的潜在靶点[12,13]。

小胶质细胞活化及其介导神经炎症反应在TBI后继发病理改变中起极其重要作用[4,12,13]，其主要表现为：致炎的M1型和抑炎的M2型两种表型。M1型分泌大量促炎因子，对中枢神经系统产生毒性损伤作用[7,8]；而M2型则却能分泌抑炎因子和神经血管生成因子，促进组织修复[5,9,11]。抑制TBI后小胶质细胞活化，改变胶质细胞M1、M2表型比例，可减轻其介导神经炎症，改善TBI患者预后[1,12,15]。本实验采用免疫荧光双染检测小胶质细胞标志物（Iba‐1+）、M1型标志物（CD16+）、M2型标志物（CD206+），发现TBI后3 d脑损伤皮层M1型小胶质细胞明显增多，相关的炎症因子TNF‐α、IL‐l和IFN‐γ血清水平均相应升高，提示在颅脑损伤早期，活化小胶质细胞介导的炎症反应在TBI后二次损害中发挥着重要作用。利用HMGB1特异性抑制剂处理TBI大鼠后，M1型小胶质细胞减少，M2型小胶质细胞明显增多，TNF‐α、IL‐1β、IL‐6和IFN‐γ水平均明显降低，Nissl染色显示的凋亡神经元显著减少，神经功能损害评分下降，神经功能明显改善。这些均表明：HMGB1通路参与调控小胶质细胞极化的过程，特异性抑制HMGB1表达能减少小胶质细胞M1亚型，增加M2亚型极化，减轻神经炎症反应，进而改善伤后神经功能。

综上所述，HMGB1通路参与调控小胶质细胞介导的神经炎症，在创伤性脑损伤中发挥着重要作用。在TBI后，特异性抑制HMGB1表达能减少小胶质细胞M1亚型，增加M2亚型极化，减轻神经炎症反应，进而改善伤后神经功能。