紫花补血草提取物对犬乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

姜琳琳 ， 孙晓宇 ， 赵尘培 ， 王 莹 ， 朱洪伟 ， 张建龙 ， 于 馨 ， 陈国忠 ， 张兴晓

(1. 鲁东大学生命科学学院 ， 山东 烟台 264025 ； 2. 烟台市芝罘区疾病预防控制中心 ， 山东 烟台 264000)

紫花补血草[Limoniumfranchetii(Debx.)Kuntze]属白花丹科(Plumbaginaceae) 补血草属(LimoniumMiller)，为中国特有种，又名烟台补血草。补血草属植物作为中草药，具有补血、散瘀、抗菌消炎及抗肿瘤等功效，但有关紫花补血草的活性成分及药理作用的研究较少[1-4]。目前，犬肿瘤的治疗多采用手术结合放化疗进行，尽管治疗效果有一定改善，但化疗药品毒副作用较大[5-6]。中草药作为天然药物，在治疗肿瘤过程中，不仅可以减轻化疗的毒副作用，而且不易产生耐药性，具有较好的应用前景[7-8]。因此，本研究以犬乳腺癌原代细胞为体外模型，采用紫花补血草提取物处理犬乳腺癌细胞，观察其对细胞增殖、迁移的影响，为进一步开发犬肿瘤治疗的天然药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 紫花补血草，采自烟台市芝罘岛海边山坡；犬肿瘤组织来源于山东农业大学动物医院就诊的病例。

1.2 主要试剂 DMEM培养基及胎牛血清，均购自美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)及MTT试剂，均购自美国Sigma公司；胰蛋白酶，购自上海碧云天公司；TRIzol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、LC-MS用各化学试剂(色谱纯)，均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3 主要仪器 超高效液相色谱仪、质谱、C18色谱柱、CO2恒温培养箱、超微量分光光度计、实时荧光定量PCR仪，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；倒置显微镜，Olympus公司产品；低速离心机，湘仪公司产品；流式细胞仪，美国BD公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 紫花补血草乙酸乙酯提取物的制备 取干燥的紫花补血草以粉碎机粉碎，用95%乙醇浸提3次,合并提取液，减压浓缩，得到总浸膏，加蒸馏水搅拌均匀成悬浮液，装入分液漏斗中，水层用乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯减压浓缩回收溶剂后，干燥，称重，备用。

1.4.2 紫花补血草乙酸乙酯提取物成分检测分析 取100 mg样品置于EP管中，加入含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液500 μL，涡旋震荡，冰浴静置5 min，15 000 r/min、4 ℃离心10 min。取一定量的上清，加质谱级水稀释至甲醇含量为53%，并置于离心管中，15 000 r/min、4 ℃ 离心10 min，收集上清，利用高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)进行分析，进样量10 μL。柱温：40 ℃；流速：0.2 mL/min；质谱采用正离子模式时，流动相为0.1% 甲酸(A)-甲醇(B)；质谱采用负离子模式时，流动相为5 mmol/L醋酸铵(pH=9.0)(A)-甲醇(B)。将下机数据(.raw)文件导入CD搜库软件中，对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析，整合目标离子，通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud、MassList和mzVault数据库进行比对，用对照样本去除背景离子，对定量结果进行归一化，最后得到数据的鉴定结果。

1.4.3 犬肿瘤组织石蜡切片H.E.染色 将犬肿瘤组织用4%的多聚甲醛溶液进行固定，使用常规石蜡进行包埋。将其进行连续切片之后，依次进行染色、脱水、透明以及封固，待切片完全干燥后置于显微镜下进行观察。

1.4.4 犬乳腺癌细胞中Ki67及HER2基因的表达 按照TRIzol试剂盒说明书对收集到的正常乳腺组织、乳腺癌组织及原代乳腺癌细胞进行Ki67、HER2总RNA的提取。取RNA样品 2 μL，用超微量分光光度计NanoDrop 2000对RNA在260 nm下的吸光度进行定量测定。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。取4 μg RNA为模板，利用反转录试剂盒合成 cDNA。按照实时定量PCR试剂盒说明书进行操作。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，总共30个循环。反应在实时荧光定量PCR仪上进行，引物序列见表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 荧光定量PCR引物Table 1 Real-time PCR primers

1.4.5 细胞培养 将无菌条件下手术切除的肿瘤组织，无菌PBS清洗3次，修剪除去纤维组织，将组织块剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的小块，无菌镊子将组织种植于24孔板中，瓶内加入DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞浓度达到70%～80%融合后，使用胰蛋白酶进行消化传代，传代后肿瘤细胞种植于25 cm2培养瓶中继续培养。加入适量胶原酶置于37 ℃、5% CO2培养箱中消化2 h，加入10%胎牛血清终止消化。取上清，1 000 r/min离心5 min。将细胞沉淀PBS洗2次，重悬于含20% 胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞浓度达到70%～80%融合后，使用胰蛋白酶进行消化传代，传代后肿瘤细胞种植于25 cm2培养瓶中继续培养。

1.4.6 MTT法检测紫花补血草乙酸乙酯提取物对犬乳腺肿瘤原代细胞增殖的影响 将180 μL犬乳腺癌细胞接种于96孔板中，每孔10 000个细胞，培养过夜。空白孔为DMEM培养基(不接种细胞)；阴性对照孔加入PBS；将紫花补血草乙酸乙酯提取物配制成初始浓度为1 mg/mL的母液，对倍稀释6个浓度梯度，依次加入试验孔中，每孔20 μL，终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25 μg/mL和3.125 μg/mL，每个浓度设置3个复孔。培养96 h，弃掉上清，加入20 μL MTT溶液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h后，加入150 μL的DMSO溶液，摇床振荡5 min，酶标仪570 nm波长检测各孔吸光值，计算不同浓度下肿瘤细胞的存活率以及细胞半数抑制浓度(50% inhibitory concentration，IC50)。

细胞存活率/%=(OD试验孔-OD空白孔)/

(OD阴性对照孔-OD空白孔)×100%

1.4.7 细胞划痕试验检测乳腺癌细胞迁移能力 将犬乳腺癌细胞接种于24孔板中，每孔1×105个细胞，培养过夜。取200 μL的枪头垂直于孔板进行细胞划痕，保证各个划痕宽度一致，弃去细胞培养液，用PBS轻柔冲洗3次，然后加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。对照组加入PBS，试验组加入15 μg/mL提取物进行处理，每组3个复孔，处理48 h。以划痕后时刻为0 h，在48 h跟踪拍摄各孔划痕状态，采用Image J软件计算细胞划痕宽度。计算划痕抑制率。

抑制率/%=(1-Δd试验组/Δd对照组)×100%

其中，Δd=宽度0 h-宽度24 h。

1.4.8 统计学分析 采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，试验数据以平均值±标准误表示，采用ANOVA进行多组间差异显著性分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 紫花补血草乙酸乙酯提取物化学成分分析 采用超高效液相色谱仪联用四级杆串联飞行时间质谱仪(UPLC-ESI-MS)，对紫花补血草乙酸乙酯提取物进行定性分析(图1)，在正离子扫描模式下，共鉴定263种化合物；在负离子模式下，共鉴定228种化合物，排名前20的如表2所示。高效液相色谱-质谱联用(LC-MC)结果鉴定表明，紫花补血草乙酸乙酯部位含有活性较强的天然黄酮类物质槲皮苷、香叶木素、木犀草素等。

图1 高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)正离子模式下鉴定结果(A)与负离子模式下鉴定结果(B)Fig.1 Application of LC/MS technology under positive ion mode (A) and negative ion mode (B)

表2 紫花补血草乙酸乙酯部位化学成分的LC-MS鉴定结果Table 2 LC-MS identification of ethyl acetate extract of Limonium franchetii

2.2 犬乳腺肿瘤组织H.E.染色 经H.E.染色后镜检，该犬乳腺肿瘤细胞大小不一，呈圆形或卵圆形/梭形等，染色较深，嗜碱性(图2)，说明此肿瘤细胞生长旺盛，分化程度低，异型性明显，细胞恶性程度较高。

2.3 犬乳腺肿瘤原代细胞的分离 犬乳腺癌细胞原代细胞培养成功，组织块种植后，可见细胞自组织块周边爬出(图3)。原代肿瘤细胞7～9 h后贴壁，细胞核、细胞膜轮廓明显，细胞形态多样，多为呈圆形或椭圆形，贴壁生长良好。

图2 犬乳腺恶性肿瘤的组织病理学检测(H.E.染色，400×)Fig.2 Histopathology of canine breast malignanttumor(H.E.staining,400×)

图3 犬乳腺癌原代细胞(400×)Fig.3 Canine breast cancer primary cells (400×)

2.4 犬乳腺肿瘤组织中基因Ki67、HER2的表达 针对分离的犬乳腺癌组织及原代细胞进行犬乳腺癌免疫标志物Ki67及HER2的基因分析。许多研究已经证实，Ki67与HER2过表达均与犬乳腺癌的发生发展有密切关系[9-13]，对肿瘤良恶性的鉴别诊断具有重要价值。结果显示，恶性肿瘤的Ki76表达量是正常乳腺组织的4.31倍，具有显著性差异(P=0.007)；HER2的表达在乳腺肿瘤组织中约为正常乳腺组织的2.38倍，具有显著性差异(P=0.003)；而Ki67及HER2在原代乳腺癌细胞中的表达与肿瘤乳腺组织一致，无统计学差异(P=0.923)(图4)。

图4 犬乳腺癌细胞中Ki 67与HER 2的mRNA相对表达量Fig.4 mRNA relative expression of Ki 67and HER 2 genes in canine breast cancer cells**：P<0.01

2.5 紫花补血草提取物对犬乳腺肿瘤原代细胞增殖的影响 采用不同浓度提取物对犬乳腺癌细胞处理48 h后，肿瘤细胞的生长受到明显抑制，见图5。随着紫花补血草提取物浓度的递增，细胞增殖的抑制效应逐渐增强，存在一定的剂量依赖性。当药物浓度为100 μg/mL时，与对照组比较，抑制率为79.75%。采用Graphpad Prism 8.0软件计算得到提取物的IC50值为29.11 μg /mL。结果表明，紫花补血草乙酸乙酯提取物对犬乳腺癌细胞的抑制作用较为明显(P<0.05)。

图5 紫花补血草乙酸乙酯提取物对犬乳腺癌细胞增殖的影响Fig.5 Effects of Limonium franchetii ethyl acetate extract on proliferation of canine breast cancer cells

2.6 紫花补血草提取物对犬乳腺肿瘤原代细胞迁移能力的影响 细胞划痕试验结果显示，当提取物浓度为15 μg/mL时，与对照组相比，犬乳腺癌细胞的迁移能力明显受到抑制(P<0.05)，抑制率为57.14%(图6)。

图6 紫花补血草乙酸乙酯提取物对犬乳腺癌细胞划痕愈合程度的影响(200×)Fig.6 Inhibitive effects of Limonium franchetii ethyl acetate extract on canine breast cancer cells in cell injury healing experiment (200×)

3 讨论

乳腺肿瘤是犬常见的肿瘤性疾病，且大多为恶性肿瘤，具有较高的死亡率，严重威胁犬类的生活健康[14]。犬的乳腺肿瘤与人的乳腺肿瘤在许多方面有着类似的特征，如组织形态学、病理生理学等。其中，肿瘤标志物是乳腺肿瘤的良恶性鉴别诊断的有效依据，并且在预后及指导治疗过程中发挥重要作用[15]。许多研究已证实，Ki67及HER2可作为乳腺肿瘤的标志物，用于诊断前、指导治疗和预后判断。本试验结果显示，Ki67及HER2基因的mRNA在恶性肿瘤组织中的表达均高于正常组织，这与Kaszak等[16]报道的结果是一致的。

目前，手术治疗方法是临床上治疗犬乳腺疾病的常用方案，联合化疗来提高动物的生存率。但化疗给患犬带来的反复呕吐与腹泻等不良反应严重降低患犬的生活质量，使得化疗方案在治疗宠物肿瘤疾病的应用推广受阻，近几年，中草药以低毒、高效、减少化疗副作用等优点，在人类肿瘤治疗中有广泛的应用，但未能广泛的应用于犬乳腺肿瘤的治疗中。因此，寻找天然的具有抗肿瘤活性的中草药，在犬肿瘤的治疗应用中具有重要意义。

国外目前尚未见对紫花补血草的研究报道，对补血草属其他植物的化学成分和药理活性进行阐述的资料较少。近年来，对天然植物黄酮的研究表明其在抗肿瘤方面具有较好疗效[17]，而前期对紫花补血草化学成分的研究也表明其中含有大量黄酮类物质。大量的研究显示，植物黄酮类成分例如槲皮素、异槲皮苷、木樨草素、芹菜素等可以抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，还能拮抗化疗药物对正常细胞的毒性、逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药[18]。严卫等研究了中华补血草多酚对白血病HL-60细胞的抗肿瘤活性，发现其可以诱导肿瘤细胞的凋亡[19]。本课题组研究发现，紫花补血草中含有大量天然黄酮类物质槲皮苷、香叶木素、木犀草素等，并对犬乳腺肿瘤细胞具有较强的抑制作用。

为了进一步明确紫花补血草黄酮类化合物的抗肿瘤机制，本试验运用细胞划痕试验，检测紫花补血草提取物对细胞迁移的影响。试验结果显示，紫花补血草乙酸乙酯提取物处理后，划痕距离变小，可以显著抑制细胞迁移进而抑制细胞增殖，提示紫花补血草生物活性物质可抑制犬乳腺癌细胞的迁移，可能是该提取物发挥抗肿瘤活性的机制之一。

综合细胞增殖和细胞迁移试验结果，初步表明紫花补血草提取物具有抗犬乳腺肿瘤的活性，能够抑制肿瘤细胞增殖，其机制可能与降低肿瘤细胞迁移水平有关。由于补血草属植物作为传统的中草药，具有较高的临床安全性，因此，有望应用于临床犬肿瘤的治疗。