雪胆多糖絮凝纯化工艺优化及其对橄榄油乳化性研究

2021-03-16梁笑茹卢迎春段柯兆张广辉杨生超赵艳

中国中医药信息杂志 2021年2期

关键词：橄榄油壳聚糖乳化

梁笑茹，卢迎春，段柯兆，张广辉，杨生超，赵艳

中药研究与开发

雪胆多糖絮凝纯化工艺优化及其对橄榄油乳化性研究

梁笑茹1，卢迎春1，段柯兆2，张广辉1，杨生超1，赵艳1，3

1.云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，云南省药用植物生物学重点实验室，云南昆明 650201；2.云南柯兆生物科技有限公司，云南昆明 650200；3.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201

采用正交设计法优化壳聚糖絮凝纯化雪胆多糖工艺，并探讨雪胆多糖对橄榄油的乳化稳定性。结合单因素试验，以絮凝时间、壳聚糖浓度和絮凝温度为考察因素，以雪胆多糖保留率为评价指标，采用正交试验优化絮凝工艺。分析雪胆多糖浓度、温度、金属离子类型及金属离子浓度对橄榄油乳化性的影响。最佳絮凝工艺为：絮凝时间60 min，壳聚糖浓度1.0 mg/mL，絮凝温度35 ℃。在此条件下，雪胆多糖保留率为82.60%±1.21%。雪胆多糖对橄榄油乳化性有显著影响，当多糖浓度为15%时稳定性最佳，65 ℃为最佳乳化温度，乳化液在0.025 mol/L硫酸钾溶液中乳化稳定性最好。本研究正交设计优化的雪胆多糖絮凝纯化工艺稳定可靠，雪胆多糖具有良好的橄榄油乳化稳定性。

多糖；雪胆；壳聚糖；絮凝工艺；橄榄油；乳化稳定性

雪胆Cogn.为葫芦科雪胆属植物，主要生长在我国热带及亚热带地区，主产于云南、四川、贵州等地[1]。雪胆富含雪胆甲素、雪胆乙素等葫芦烷型四环三萜化合物[2-5]，雪胆皂苷A、雪胆皂苷B等20余种齐墩果烷型五环三萜类化合物[6]，这些三萜类化合物具有抗肿瘤[7]、抗HIV[8]活性，药用价值较高。

由于多糖和蛋白质均为亲水性分子，去除蛋白质会伴随多糖的损失[9]。目前常用的多糖脱蛋白方法有Sevage法[10-11]、酶法[12-13]和三氯乙酸法[14-15]等，但除杂纯化效果有一定差异。在简单固液两相分离的方法中，絮凝沉淀法可以较好地去除杂质并保留有效成分[16-17]。絮凝法常用的天然阳离子型絮凝剂壳聚糖具有吸附杂质和电中和作用，在中药制药[18-20]、食品生产[21-23]等领域应用较广。潘美云等[24]采用响应面法优化丹参饮水提液壳聚糖絮凝工艺，结果表明该方法能有效絮凝并沉降提取液中的胶体和蛋白质等微粒。张建伟等[25]优化壳聚糖絮凝纯化白芍工艺，结果表明壳聚糖能有效去除白芍中的杂质成分而有效成分损失少。满宁等[26]利用微波提取灰树花子实体中的多糖并以壳聚糖为絮凝剂进行纯化，与醇沉法相比，絮凝法操作时间大大缩短且多糖纯度高。

另外，由于多糖是良好的增稠保水剂，来源于植物的水溶性多糖具有高黏度和强吸水性的特点，可以作为天然乳化剂代替合成表面活性剂，应用于乳化领域。研究表明，山药多糖具有乳化性，当浓度较低时就可达到有效的乳化性能[27]。石莼多糖能提高β-胡萝卜素的生物利用度，与阿拉伯胶相比，具有更高的脂质消化率[28]。张云天[29]研究发现，青砖茶多糖是一个良好的天然乳化剂，能够降低界面张力，具有良好的乳化活性，并能稳定乳液储藏。雪胆多糖的絮凝纯化工艺及乳化稳定性研究尚未见报道。本研究以雪胆块茎为研究材料，结合单因素试验，通过3因素4水平正交试验，优化雪胆多糖的絮凝纯化工艺，并探讨雪胆多糖的橄榄油乳化稳定性，为雪胆多糖的开发利用提供试验依据。

1 仪器与试药

722N可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），电子天平（Sarrorius公司），旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂），数显恒温水浴锅（上海双捷实验设备有限公司）。

雪胆采自云南柯兆生物科技有限公司的雪胆种植基地，经云南民族大学杨青松副教授鉴定为葫芦科雪胆属植物雪胆Cogn.。雪胆块茎粉碎后过100目筛，置于密封干燥器中，备用。葡萄糖、磷酸二氢钾、壳聚糖、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硫酸钠、硫酸铝、硫酸镁、硫酸钾均为分析纯（天津市风船化学试剂科技有限公司），氯仿、无水乙醇、正丁醇、浓硫酸、苯酚、冰醋酸均为分析纯（重庆川东化工有限公司），橄榄油为分析纯（中国医药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 雪胆多糖提取液制备及含量测定

称取雪胆块茎粉末5 g，按样品与水1∶16的料液比，80 ℃水浴加热2 h，重复提取3次，离心，取上清液，合并，用旋转蒸发仪减压浓缩，80 ℃水浴浓缩至原溶液的1/4左右，加无水乙醇混匀后于4 ℃冰箱静置12 h，将醇沉提取液取出，2500 r/min离心3 min，保留沉淀物质。

准确称取0.10 g干燥至恒重的无水葡萄糖对照品，加蒸馏水制成0.20 mg/mL对照品溶液。吸取对照品溶液，分别稀释为0.05、0.10、0.15、0.20 mg/mL溶液。吸取上述溶液1 mL，加5%苯酚溶液1 mL，再加浓硫酸8 mL，摇匀，40 ℃水浴保温30 min，室温冷却，以加蒸馏水的空白溶液作对照，于波长486 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程＝8.072＋0.012 6（²＝0.999 7），线性关系良好。

2.2 雪胆多糖絮凝工艺优化

2.2.1 絮凝剂制备

称取1 g壳聚糖，加入1%冰醋酸溶液100 mL，混匀溶胀后得到1%壳聚糖溶液。

2.2.2 单因素试验

2.2.2.1 絮凝时间

在雪胆多糖提取液中加入1.5 mg/mL壳聚糖溶液，于35 ℃分别处理20、40、60、80、100 min，在波长486 nm处重复测定吸光度3次，考察絮凝时间对雪胆多糖保留率的影响。保留率（%）＝（絮凝前多糖含量－絮凝后多糖含量）÷絮凝前多糖含量×100%。结果表明，随絮凝时间延长，雪胆多糖保留率呈先升高后趋于平缓再急剧下降的趋势，最大保留率出现在60～80 min，见图1。絮凝20 min时，壳聚糖与提取液作用时间过短，此时蛋白质去除效果较弱；随着时间延长，多糖保留率提高，效果较好；絮凝时间超过80 min，部分絮凝沉淀物开始溶解，导致保留率降低。因此，选择絮凝时间为60～80 min。

2.2.2.2 壳聚糖浓度

在雪胆多糖提取液中分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL壳聚糖溶液，35 ℃絮凝处理60 min，于波长486 nm处重复测定吸光度3次，考察不同壳聚糖浓度对雪胆多糖保留率的影响。结果表明，雪胆多糖保留率随壳聚糖浓度升高呈下降趋势，见图2。当壳聚糖浓度为0.5～1.5 mg/mL时多糖保留率下降程度较大，壳聚糖浓度为1.5～2.5 mg/mL时多糖保留率下降趋势较为平缓。可能由于壳聚糖浓度增高，导致多糖溶液胶体颗粒表面吸附大量高分子物质而产生空间保护层，使絮凝效果减弱。因此，絮凝时选择壳聚糖浓度为1.5 mg/mL。

图1 不同絮凝时间的雪胆多糖保留率

图2 不同壳聚糖浓度的雪胆多糖保留率

2.2.2.3 絮凝温度

在雪胆多糖提取液中加入1.5 mg/mL壳聚糖溶液，分别于35、45、55、65、75 ℃絮凝处理60 min，于波长486 nm处重复测定吸光度3次，考察不同絮凝温度对雪胆多糖保留率的影响。结果表明，在35～75 ℃范围内雪胆多糖保留率呈下降趋势，见图3。可能随着温度升高，提取液中分子运动加快，增加了壳聚糖与溶液中杂质的接触，使吸附性显著提高，导致部分多糖絮凝沉淀，故絮凝时不宜选择较高温度。

2.2.3 正交试验设计与结果

结合单因素试验结果，选择絮凝时间、壳聚糖浓度、絮凝温度为考察因素，每个因素选取4个水平，以雪胆多糖保留率为考察指标，采用L16（43）正交表进行试验设计，优化絮凝工艺。试验设计见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。

图3 不同絮凝温度的雪胆多糖保留率

表1 雪胆多糖絮凝工艺正交试验因素与水平

表2 雪胆多糖絮凝工艺正交试验设计与结果

表3 雪胆多糖絮凝工艺正交试验结果方差分析

根据表2、表3分析可知，各因素对雪胆多糖保留率的影响为絮凝时间（A）＞壳聚糖浓度（B）＞絮凝温度（C），其中，絮凝时间有显著影响（＜0.01），壳聚糖浓度和絮凝温度无显著影响（＞0.05）。根据正交试验结果得到理论优化方案为A2B2C1，即絮凝时间60 min、壳聚糖浓度1.0 mg/mL、温度35 ℃。

2.3 验证试验

选择最优工艺条件平行进行3次试验验证，结果表明，雪胆多糖保留率为82.60%±1.21%，与正交试验最优结果82.98%±1.16%相差较小，表明该絮凝工艺具有稳定性和可行性。

2.4 雪胆多糖提取液对橄榄油乳化性的影响

2.4.1 雪胆多糖浓度

取雪胆多糖，分别配制为5%、10%、15%、20%、25%溶液。取不同浓度雪胆多糖溶液3 mL，分别加入1 mL橄榄油，用匀质器混匀。用移液枪取200 μL上述不同浓度乳状溶液于试管中，分别加入1%SDS溶液10 mL，摇匀，于波长486 nm处重复测定吸光度（A0）3次，剩余乳浊液静置10 min后再取200 μL，加入1%SDS溶液10 mL，于波长486 nm处重复测定吸光度（A1）3次，计算乳化稳定性（ESI）。ESI＝[A0／（A0－A1）]×t，式中t为静置时间，即10 min。结果表明，多糖浓度为5%～15%时，雪胆多糖橄榄油乳化稳定性呈上升趋势，当多糖浓度为15%时乳化稳定性最大，随多糖浓度升高，其橄榄油乳化稳定性呈降低趋势，见图4。乳化液稳定的主要原因是水油界面形成了有一定弹性和机械强度的保护薄膜，高浓度多糖溶液虽然乳化性较强，但形成的保护膜不稳定，容易破裂，出现破乳现象，导致乳化稳定性降低。

图4 不同浓度雪胆多糖对橄榄油的乳化稳定性

2.4.2 温度

取15%雪胆多糖溶液3 mL，分别于4、25、45、65、85 ℃放置25 min，加入1 mL橄榄油，用匀质器混匀。用移液枪取200 μL乳状溶液于试管中，加入1%SDS溶液10 mL，摇匀，于波长486 nm处重复测定吸光度3次，剩余乳浊液放置10 min后再取200 μL，加入1%SDS溶液10 mL，于波长486 nm处重复测定吸光度3次，计算ESI。结果表明，4～45 ℃时雪胆多糖对橄榄油的乳化稳定性呈先升高后小幅降低趋势，45～65 ℃时升高幅度较大，65 ℃时达到最大值，65～85 ℃时急剧下降，见图5。可能由于高温（超过65 ℃）使乳化液黏度和多糖在界面上的吸附量降低，导致乳化液稳定性降低。

图5 不同温度下雪胆多糖对橄榄油的乳化稳定性

2.4.3 金属离子

于室温25 ℃取15%雪胆多糖溶液3 mL，分别加入0.01 mol/L的Na2SO4、K2SO4、MgSO4、CuSO4、ZnSO4、Al2(SO4)3、Mn2SO4溶液2 mL，再分别加入1 mL橄榄油，用匀质器混匀。用移液枪取200 μL乳状溶液于试管中，加入1%SDS溶液10 mL，摇匀，于波长486 nm处重复测定吸光度3次，剩余乳浊液放置10 min后再取200 μL，加入1%SDS溶液10 mL，于波长486 nm处重复测定吸光度3次，计算ESI，结果见图6。含有K+、Zn2+、Mn2+的溶液中，雪胆多糖对橄榄油的乳化稳定性较好，其中含有K+的溶液稳定性最好；含有Na+、Mg2+、Cu2+、Al3+的溶液橄榄油乳化稳定性较低，其中含有Al3+的溶液橄榄油乳化稳定性最弱。可能由于Mg2+、Al3+等离子与雪胆多糖发生了化学反应（如络合反应、氧化反应等），使溶液中多糖含量降低，溶液黏度降低，油滴分子运动加快，导致乳化稳定性降低。

2.4.4 离子浓度

于室温25 ℃取15%多糖溶液3 mL，选取“2.4.3”项下乳化稳定性最优的K+溶液，分别向试管中加入0.01、0.025、0.05、0.10 mol/L的K2SO4溶液2 mL，再加1 mL橄榄油，用匀质器混匀。用移液枪取200 μL乳状溶液于试管中，加入1%SDS溶液10 mL，摇匀，于波长486 nm处重复测定吸光度3次，剩余乳浊液放置10 min后再取200 μL，加入1%SDS溶液10 mL，于波长486 nm处重复测定吸光度3次，计算ESI，结果见图7。雪胆多糖对橄榄油的乳化稳定性随K2SO4溶液浓度增大先升高后降低，在浓度为0.025 mol/L时稳定性最好。当K2SO4溶液浓度低于0.025 mol/L时，浓度增高使多糖更易溶解，而溶液中离子浓度过高可破坏多糖与橄榄油形成的保护膜，导致乳化液稳定性降低。

图6 不同金属离子溶液的雪胆多糖对橄榄油的乳化稳定性

图7 不同浓度K2SO4溶液的雪胆多糖对橄榄油的乳化稳定性

3 讨论

常用絮凝剂壳聚糖具有长链架桥型和阳离子型2种除杂作用，在中药提取加工过程中，能有效沉降不稳定杂质，保留有效成分。本研究选用絮凝时间、壳聚糖浓度和絮凝温度3个因素，根据单因素试验结果设计正交试验方案，得到雪胆多糖的絮凝纯化工艺：絮凝时间60 min，壳聚糖浓度1.0 mg/mL，絮凝温度35 ℃。在此条件下，雪胆多糖的保留率为82.98%±1.16%。验证试验结果显示，雪胆多糖保留率为82.60%±1.21%，二者差异较小，表明壳聚糖絮凝工艺稳定可靠。

本研究结果表明，雪胆多糖对橄榄油的乳化性有显著影响。随雪胆多糖浓度增加，乳化稳定性呈先升高后降低趋势，当多糖浓度为15%时稳定性最佳。65 ℃为最佳乳化温度，温度过高或过低则乳化液稳定性降低。当体系中含有K+时，橄榄油乳化液的稳定性最好。高浓度K+会降低稳定性，K+浓度较低时有助于乳化，选用0.025 mol/L的K+溶液时乳化稳定性最好。

本研究通过正交设计试验优化了壳聚糖絮凝法纯化雪胆多糖的工艺条件，在此条件下絮凝法纯化用时短，除杂效果好；同时，雪胆多糖能作为乳化剂使用。本研究为雪胆的进一步开发利用提供了新方法，并为雪胆的精深加工及应用提供了试验依据。

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Optimization of Flocculation and Purification Process of Polysaccharides fromand Effects on Emulsification Stability for Olive Oil

LIANG Xiaoru1, LU Yingchun1, DUAN Kezhao2, ZHANG Guanghui1, YANG Shengchao1, ZHAO Yan1,3

To optimize the technique of flocculation and purification of polysaccharides fromthrough orthogonal test; To explore emulsification stability of polysaccharides for olive oil.Based on the single factor test, the flocculation time, chitosan concentration and flocculation temperature were used as investigator factors, and the retention rate of polysaccharide fromwas evaluated as an index. The orthogonal test was used to optimize flocculation technique, and the effects of polysaccharides from, temperature, metal ions types and metal ions concentration on emulsification of olive oil were analyzed.The optimal flocculation conditions were as follow: flocculation time was 60 min, chitosan concentration was 1.0 mg/mL, and flocculation temperature was 35 ℃, the retention rate of polysaccharide was 82.60%±1.21%. Polysaccharide fromhad significant effect on the emulsification of olive oil. The emulsification stability was best while polysaccharide concentration was 15%, emulsification temperature was 65 ℃, and the concentration of K2SO4was 0.025 mol/L.The optimized flocculation and purification process of polysaccharide fromare stable and reliable by orthogonal test. Polysaccharide fromhas good emulsification stability for olive oil.

polysaccharide;; chitosan; flocculation process; olive oil; emulsification stability

R284.2

1005-5304(2021)02-0081-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005032