基于响应面法优化水提紫娟茶花青素工艺

张钎，沈雪梅，刘琨毅，张纪伟，周艺凡，李光秀，李家华

(1.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201；2.昆明市农业科学研究院，云南 昆明 650201；3.宜宾职业技术学院，五粮液技术与食品工程学院，四川 宜宾 644003；4.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；5.盐津县农业技术推广中心，云南 盐津 657500)

紫娟茶(Camelliasinensisvar.assamica)是云南所特有的茶树特异新品种，其除含有其他茶叶中所含有的儿茶素、茶氨酸和咖啡碱等生化成分外，花青素含量高是其特有的品种特征之一[1-2].大量的研究证实，花青素对心血管疾病具有良好的预防作用[3-4]，具有抗氧化和清除自由基[5-6]、抗突变及抗肿瘤[7-8]、改善人眼机能与预防眼疾[9-10]、减轻肝功能障碍[11]和抗炎及抗过敏[12]等生理功能.因此，近年来，国内外学者针对茶树种质中花青素含量较高、芽叶呈紫红色的茶树品种中花青素方面开展了一定的研究，也获得了部分研究成果[13-16].

目前，为深度开发利用紫娟茶及其花青素资源奠定相关基础，提高紫娟茶花青素的提取率，有研究者围绕紫娟茶花青素的提取方法开展了有意义的研究，如罗正飞等[17]以70%乙醇水溶液为提取溶剂，以回流提取方法开展了紫娟茶花青素提取工艺的研究，并获得了最佳醇提工艺；费旭元[18]、李璐[19]等分别采用酸性1%和1.5 N的盐酸甲醇为提取溶剂，开展了紫娟茶中花青素提取工艺的研究，并利用响应面法优化了酸性甲醇提取紫娟茶中花青素的工艺.但是，仔细考量上述提取方法，可以发现上述研究都以乙醇、甲醇等有机溶剂为提取溶剂，以盐酸为酸化剂，如在未来将紫娟茶花青素的应用领域扩大的药品、食品以及化妆品等领域，需要工厂化提取紫娟茶花青素时，出于安全性考虑，用有机溶剂、盐酸等化学制剂作为提取溶剂将变为不可能.所以，有必要开展环保、经济的紫娟茶中花青素的提取方法的研究.基于此，本试验利用食品级柠檬酸为酸化剂，纯净水为提取溶剂，在单因素试验的基础上，利用响应面法优化紫娟茶中花青素提取工艺，以期获得高效、经济、环保的提取方法，为扩大紫娟茶花青素在食品、药品以及化妆品等与紫娟茶相关的延伸产品的开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

紫娟茶晒青绿茶(云南省农科院茶叶研究所提供)，粉碎后作为分析样品备用；无水乙醇、盐酸(均为分析纯，无锡市亚泰联合化工有限公司)，无水柠檬酸(食品级，山东优索化工科技有限公司)；纯净水(昆明珍茗食品有限责任公司).

1.2 仪器与设备

JA1003型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，756CRT型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，HH-S28型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，AQ-180E型食品加工机(慈溪市耐欧电器有限公司).

1.3 试验方法

1.3.1 单因素优化试验 参考李璐等[19]的方法并加以调整，取1.000 g 样品，以0.07%柠檬酸水溶液作为溶剂，料液比为1∶35，在70 ℃提取15 min的条件下，保持其它因素不变，只改变其中一个因素，设置提取温度40、50、60、70、80 ℃，料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45(M∶V)，提取时间5、10、15、20、25 min，以花青素质量浓度为指标，试验重复3次，开展单因素试验.

参考文献[20-21]的方法，吸取4 mL花青素待测液于刻度试管内，加入6 mL酸性乙醇(作为显色剂)，显色30 min后，于535 nm波长处测定吸光度，用1 cm比色皿，并用酸性乙醇做空白.试验数据需要重复测定3次.

根据公式计算其花青素的质量浓度：

花青素质量浓度(mg/mL)=[(A待测样-A对照样)×101.83]/[吸取供液量(mL)×样品干质量(g)]

1.3.2 响应面优化试验 基于单因素考察结果，在较优的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，进行分析试验[22]，确定以水为溶剂优化提取花青素的工艺条件，因素水平如表1所示.

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.4 数据处理

试验采用Origin 2018软件进行数据制图，SPSS 24软件进行数据分析，Design Expert 12软件进行响应面设计及结果分析.

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同水浴温度对花青素提取效果的影响 控制处理条件为提取时间15 min、料液比1∶35(M∶V)，考察在提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃时紫娟茶花青素质量浓度，结果见图1.由图1可知，花青素质量浓度随着温度的提高而上升，至70 ℃达到最高值(6.314±0.294)mg/mL，且与其他温度所提取花青素质量浓度有显著差异(P<0.05).虽然温度高有利于花青素的提取，但花青素热稳定性较差，在高温环境下较易分解，因此随着温度的继续上升，花青素质量浓度呈现下降的趋势.故选用温度为60 ℃、70 ℃及80 ℃用于后续响应面法试验.

2.1.2 不同料液比对花青素提取效果的影响 以0.07%柠檬酸水溶液为溶剂，不同提取温度单因素试验结果为依据，设定提取温度为70 ℃，提取时间为15 min，考察不同料液比(1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45)紫娟茶花青素质量浓度.由图2可知，花青素质量浓度随着料液比的增大而上升，至料液比为1∶35时达到最高值(5.694±0.480)mg/mL，且与其他料液比所提取花青素质量浓度有显著差异(P<0.05).当料液比达到1∶40时，提取率不升反降.因此，考虑到提取效果以及提取成本等因素，选择1∶30、1∶35以及1∶40用于响应面法试验.

不同字母表示差异显著(P<0.05).Different lower case letters significant show differences.图1 不同温度的提取效果比较Figure 1 Comparison of different temperature on the extraction effect

不同字母表示差异显著(P<0.05).Different lower case letters significant show differences.图2 不同料液比提取效果比较Figure 2 Comparison of different solid-liquid ratio on the extraction Effect

2.1.3 不同水浴提取时间对花青素提取效果的影响 以0.07%柠檬酸水溶液为溶剂，不同提取温度以及不同料液比单因素试验结果为依据，设定提取温度为70 ℃，料液比为1∶35，考察提取时间分别在10、12.5、15、17.5、20 min时紫娟茶花青素质量浓度.由图3可知，花青素质量浓度呈现先升后降的趋势，当提取时间从10 min增加到15 min时，花青素质量浓度显著增加(P<0.05)，最高达到(5.598±0.170)mg/mL；当提取时间继续增加后，花青素质量浓度显著降低(P<0.05)，因过长的提取处理会破坏花青素的结构.故选择12.5 min、15 min以及17.5 min用于响应面法试验.

不同字母表示差异显著(P<0.05).Different lower case letters significant show differences.图3 不同时间提取效果比较Figure 3 Comparison of different time on the extraction effect

2.2 响应面法优化结果

根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理与试验，对温度、料液比、时间3个因素分析得到以下试验方案及结果见表2.再通过Design-Expert 软件对响应面法试验得到花青素质量浓度进行方差分析，得到结果如表3所示.

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

由表3可知，3个因素对水提紫娟茶花青素质量浓度高低影响的强弱顺序依次为：时间>温度>料液比，其中时间对水提紫娟茶花青素质量浓度高低的影响极为显著(P<0.01)，温度对水体紫娟茶花青素质量浓度高低的影响为显著(P<0.05).设提取温度、料液比、提取时间、分别为A、B、C，以花青素质量浓度为响应值，经多元回归拟合后，得到水提紫娟茶中花青素质量浓度回归方程：花青素质量浓度=6.29+0.358 1A-0.318 6B-0.537 6C-0.112 5AB+0.234 5AC-0.130 4BC-0.717 3A2-0.189 3B2+0.000 5C2.失拟值不显著(P>0.05)，表明该回归方程拟合程度好.决定系数接近0.9，表明该模型的准确性很好.

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[23-25]，根据水提紫娟茶中花青素质量浓度回归方程得出不同因子的响应面分析图结果见图4.

由图4知，因子A(温度)与因子B(料液比)之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中最为陡峭，即因子A与因子B相互之间具有最强的交互作用.因子A(温度)与因子C(时间)之间的交互作用次之，因子B(料液比)与因子C(时间)之间的交互作用最弱.

通过响应面分析确定水提紫娟茶中花青素工艺为提取温度为71.288 1 ℃，料液比1∶32.320 1，提取时间12.5000min，此条件下由公式算出的花青素质量浓度为6.882 0 mg/mL.根据所得的分析数据进行3组验证试验，验证试验的条件为温度71.3 ℃，料液比1∶32及提取时间12.5 min，得到浸提液中花青素质量浓度平均值为6.908 mg/mL，测定结果稳定，偏差不大，且优于理论值，证明该结果合理可靠.

不同字母表示差异显著(P<0.05).Different letters indicate significant differences(P<0.05).图4 各因素交互作用的响应面曲线及等高线Figure 4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors

3 讨论

目前，关于植物中花青素提取工艺的研究已有较多报道.如肖丽霞等[26]利用酸醇提取紫玉米花青素能得到较高的提取率(27.6 mg/g).杨玲等[27]分析了不同提取溶剂对紫罗兰马铃薯花青素含量的影响，结果表明，酸性乙醇溶液提取率最高，为16.2 mg/g.因花青素结构呈极性，故多项研究均用甲醇等极性溶剂.但若要将所提取的花青素直接用于食品以及化妆品开发应用领域，则有必要用水代替酸性极性溶剂.

罗正飞等[17]选用乙醇为溶剂，进行正交试验得出提取紫娟茶中花青素条件70%乙醇溶液，以1∶10料液比在80 ℃下回流提取30 min，得出结果为1.68 mg/mL，远低于本试验结果.费旭元等[18]利用响应面法对紫娟中花青素提取工艺进行优化，得到结果为采用酸性甲醇为提取溶剂，提取温度 29 ℃，提取时间132 min，料液比1∶26；提取结果为5.94 mg/mL.但提取时间超过2 h，可能导致花青素降解.李璐等[19]同样对紫娟茶花青素提取工艺进行了优化，得到结果为酸性甲醇为溶剂、提取温度为30.5 ℃，料液比为1∶41，提取时间为60.6 min为最佳提取方案，提取结果为5.926 mg/mL，与费旭元等[18]所得提取结果基本一致，与本试验提取结果相比少了将近1 mg/mL，且浸提时间是本试验优化结果的4倍左右.根据李燕丽等[28]研究发现，春季到夏季紫娟茶花色苷质量分数在急剧上升，李璐等[19]所用茶样与本试验所用茶样采集月份不同，可能是提取结果不同的另一原因.涂云飞等[29]使用70%乙醇提取紫娟茶中原花青素发现提取温度为70 ℃，原花青素浸出率与其他梯度有显著差异，这与本试验的71.3 ℃基本一致，但是本试验所用提取时间较短，可以较大程度减少花青素在提取过程中的损耗.本试验利用Box- Benhnken中心组合试验设计原理采用响应面法对紫娟茶花青素提取工艺做出了优化，发现提取时间对提取效果影响较大，这与吕海鹏等[30]所得结果有一定出入，可能是因为吕海鹏等以蒸馏水作为提取溶剂，且没有添加酸化剂.因花青素结构具有碱性不稳定性，前人多在花青素提取体系中加入盐酸，可增强花青素在提取过程中的稳定性，但盐酸具有一定的腐蚀性且对人体有一定毒性，所提取的提取物不能直接用于护肤品、食品等相关产品的开发.因此，本研究在前期试验的基础上采用0.07%柠檬酸溶液为酸性溶剂，在单因素试验的基础上利用响应面法优化水提紫娟茶中花青素的工艺，并由此将所提取得到的花青素进行浓缩用于后续相关产品的开发，能够在一定程度上降低提取成本.

4 结论

在单因素试验的基础上采用响应面法对水提紫娟茶中花青素工艺进行了优化，确定了其最优工艺条件为：0.07%柠檬酸溶液为溶剂，提取温度为71.3 ℃，料液比1∶32(M∶V)，提取时间12.5 min.在此条件下得到提取结果为6.908 mg/mL.构建了以柠檬酸为酸化剂、纯净水为提取溶剂的一种高效、经济环保、工艺可行的紫娟茶花青素提取方法