丹参叶柄遗传转化体系的建立及EDT1基因的导入

张换样，李静，朱永红，秦丽霞，竹梦婕，吴慎杰，焦改丽

(山西农业大学棉花研究所，山西 运城 044000)

丹参是著名的传统中草药之一，广泛应用于预防和治疗高血脂，心脑血管，和急性缺血性中风等疾病.以丹参为主的多种复方制剂如复方丹参注射液、复方丹参片、复方丹参胶囊和复方丹参滴丸等被广泛用于临床治疗心血管疾病、肾病、肝病及抗感染等[1].

我国大部分丹参种植区位于黄土高原干旱半干旱生态区，常年降雨量较少，丹参生长期内常受到干旱胁迫，干旱胁迫引起丹参根部生长不良，对丹参的生长发育和药用成分造成很大影响,因此增强丹参抗旱能力有非常重要的意义[2-3].高效的丹参遗传转化体系，对于创制优良丹参种质资源、研究丹参代谢调控机理具有重要意义[4-6].目前不少研究单位已经初步建立了丹参的遗传转化体系.但常用的以丹参叶片和茎段为外植体进行遗传转化，存在不易操作，分化率低等很多问题.本研究以叶柄为外植体进行遗传转化可以有效解决这些问题.从拟南芥耐旱突变体edt1中分离克隆出的EDT1基因,在干旱胁迫下调控一系列耐旱基因表达和信号转导,在野生型拟南芥和烟草中过表达EDT1,不但显著增强抗旱性与改良根系构型,提高光合效率和水分利用率.本研究以叶柄为外植体拟建立一套高效的丹参遗传转化体系，并将EDT1基因转入常规的丹参栽培品种中，以期获得抗旱性增强的优良丹参种质材料[7].

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 受体材料 本研究选用HLM(成都电子科技大学提供)为受体丹参品种.

1.1.2 外源植物表达载体 外源植物表达载体为pCB3000-EDT1为人工合成载体，pCB系列的植物表达载体及相关元件已在植物基因操作中广泛应用[7]，所用启动子为35S启动子，控制基因在转基因植物不同的组织和器官内都有表达，长835 bp，来自花椰菜花叶病毒.终止子为Nos，来源为农杆菌Ti质粒胭脂碱合成酶基因的终止子序列.

1.1.3 培养基配方 共培养及愈伤组织诱导培养基：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；抗性愈伤组织筛选培养基：MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+50 mg/L卡那霉素(Kan)+500 mg/L潮霉素(Cef)；生根培养基： 1/2 MS+250 mg/L Cef.以上所有培养基 pH值均为5.8，121 ℃高压灭菌15 min，卡那霉素和头孢霉素在灭菌后温度降至60 ℃左右时于超净工作台加入.培养室温度为(25±2)℃，光周期条件为16 h/8 h，光照强度为2 000 lx，其中共培为暗培养[8-9].

图1 pCB3000-EDT1载体图谱Figure1 Map of Vector pCB3000-EDT1

1.2 方法

1.2.1 丹参无菌苗的制备 将丹参种子用4% NaClO溶液浸泡5 min，再用30% H2O2溶液浸泡5 min，然后用无菌水清洗3遍，接种于1/2 MS培养基上，3 d后开始发芽，分别取发芽14 d的叶片、叶柄和茎段作为外植体.

1.2.2 农杆菌的活化与外植体的浸染、转化、筛选、再生 挑取单菌落,接种于液体培养基中加入Kan 50 mg/L及利福平(rif)20 mg/L,28 ℃、180 r/min振荡培养24 h.将菌液倒入无菌离心管中,离心5 min,弃上清,加入液体培养基稀释.将外植体材料放入稀释后的菌液中浸染15 min,取出用无菌滤纸吸去菌液.将外植体放入共培培养基上避光培养48 h.

将共培48 h后的外植体转接于含有卡那霉素和头孢霉素的筛选培养上继续培养.每15 d更换1次培养基.待再生芽长到1 cm左右时,转入生根培养基生根.生根后的再生株经PCR检测并移栽到温室花盆中.

1.2.3 不同外植体的转化效率比较 以叶片(0.5 cm×0.5 cm)、叶柄(1 cm)、茎段(1 cm)为外植体，分别选50个外植体在1.2.2的条件下进行浸染转化，3次重复，分别于共培后30 d、45 d和60 d统计分化出再生芽的外植体数.比较3种外植体的转化效率.

1.2.4 菌液浓度和浸染时间的转化效率比较 收集D600=0.6时的农杆菌,用MS液体培养基分别稀释至菌浓度为D600=0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6的浓度梯度,设计不同的浸染时间(10、15、20、30、60 min)进行浸染处理.共培养48 h后,在含卡那霉素50 mg/L的培养基上筛选,每15d更换一次培养基,统计外植体分化率.

1.2.5 转EDT1基因丹参再生株的PCR检测 取少量丹参再生株叶片(T0)与受体对照(CK)叶片，利用CTAB法提取总 DNA.EDT1基因的扩增引物为P1：5′-AACTGGTTGTGGACCTTTTGGT-3′和 P2：5′-TCGACAAGTGCCATAGCATTCA -3′，扩增产物片段大小为557 bp.PCR反应程序为：95℃预变性3 min，然后94 ℃变性30 s；62 ℃退火30 s；72 ℃，延伸60 s；40个循环，最后再72 ℃延伸10 min.扩增产物1.0%琼脂糖凝胶电泳检测[10-13].

1.2.6 转EDT1基因丹参再生株的抗旱性鉴定 获得的转基因丹参T0代植株及其受体对照移栽到花盆中，成活后停止浇水，20 d后复水，比较复水后转EDT1基因丹参与其受体对照生长情况，初步鉴定转EDT1基因丹参的抗旱性.

2 结果与分析

2.1 不同外植体的转化效率比较

以丹参叶柄、叶片和茎段作为外植体进行比较，不同外植体的分化情况不同，以叶柄作为外植体分化和再生都相对较好(图2).对不同外植体浸染培养不同时间的分化率和最终成苗数进行统计，如表1所示，不同丹参外植体的转化效率差异显著，分化速度也有明显差异.培养30 d后，叶柄外植体与茎段差异显著(P<0.05)，与叶片差异不显著(P<0.05)，叶片与茎段之间差异不显著.培养45d后叶柄与叶片和茎段之间差异极显著，叶片与茎段之间差异不显著.培养60 d后，叶柄与叶片和茎段之间差异极显著，叶片与茎段之间差异不显著.最终成活再生苗数叶柄与叶片和茎段之间差异极显著，叶片与茎段之间差异不显著.以丹参叶柄作为外植体分化率高、分化速度快，比叶片和茎段有明显的优势.而且以叶柄作为外植体相对于叶片操作更方便，后期培养更易于消除农杆菌污染，减少细菌污染几率.

A、B、C：以叶片为外植体转化丹参；D、E、F：以叶柄为外植体转化丹参；G、H、I：以茎段为外植体转化丹参.A、B、C：Transforming Salvia miltiorrhiza with leaves as explants；D、E、F：Transforming Salvia miltiorrhiza with leaflets as explants;G、H、I：Transforming Salvia miltiorrhiza with stem segments as explants.图2 不同外植体转化丹参比较Figure 2 Comparison of Salvia miltiorrhiza transformation with different exoplants

表1 不同外植体的转化效率比较Table 1 Comparison of conversion efficiency of different explants

2.2 转EDT1基因丹参植株的获得

经种子消毒处理获得的丹参无菌苗14 d叶龄叶柄切成1 cm左右的小段，经农杆菌浸染、共培48 h后,转移到含50 mg/LKan的筛选培养基上，每15 d继代一次，经筛选共获得44个克隆的142个阳性再生株(图 3).

A:丹参叶片农杆菌浸染；B:丹参叶片浸染后诱导愈伤和出芽；C：丹参茎段农杆菌浸染；D:丹参茎段浸染后诱导愈伤和出芽；E:丹参叶柄农杆菌浸染；F：丹参叶柄浸染后诱导愈伤和出芽；G：丹参再生株获得；H:丹参再生株获得.A：Agrobacterium tumefaciens of Salvia miltiorrhiza leaves；B：Induction of callus and budding of Agrobacterium tumefaciens Salvia miltiorrhiza leaves；C：Agrobacterium tumefaciens in stem segment of Salvia miltiorrhiza；D：Induction of callus and budding of Salvia miltiorrhiza stems after soaking；E：Salvia miltiorrhiza petioles impregnated with Agrobacterium tumefaciens；F：Induction of callus and budding of Salvia miltiorrhiza after soaking；G：Obtaining of Salvia miltiorrhiza regeneration plant；H：Obtaining of Salvia miltiorrhiza regeneration plant.图3 转EDT1基因丹参的获得Figure 3 Acquisition of EDT1gene Salvia miltiorrhiza

2.3 农杆菌液浓度及浸染时间对丹参转化效率的影响

如图4所示结果表明，农杆菌浓度和浸染时间对丹参的转化效率有显著影响.相同农杆菌液浓度不同浸染时间比较结果表明，浸染15 min与其它浸染时间比较，分化率显著提高.相同浸染时间不同农杆菌液浓度的转化率比较结果表明，在所有的浸染时间中，农杆菌液浓度D600=0.4时分化率显著高于其它浓度.根据试验结果，选择农杆菌液浓度D600=0.4，浸染时间15 min作为最适宜的浸染条件.

图4 农杆菌液浓度及浸染时间对丹参分化率的影响Figure 4 Effect on differentiation rate of Salvia miltiorrhiza of Agrobacterium tumefaciens concentration and soaking time

2.4 转EDT1基因丹参再生株的PCR检测

PCR检测结果表明，共获得44个克隆的142个阳性再生株.142个阳性株均扩增出大小相同，长度为 557 bp的目标条带，空白对照和受体对照均未扩增出目标条带(图5)，证明外源基因EDT1已导入受体丹参基因组 DNA中.

2.6 转EDT1基因丹参再生株的抗旱性鉴定

经PCR检测为阳性的转基因丹参植株，经扩繁后，移栽到网室花盆中.为鉴定转基因丹参植株的抗旱性，选取4个阳性再生株系与其受体对照，干旱胁迫 20 d，当转基因株系与对照均表现萎蔫，这时进行复水处理，复水后转基因植株恢复生长，受体对照不能恢复生长.表明转EDT1基因丹参比其受体对照抗旱性增强(图6).

M：mark2000;1:空白对照；2：受体对照；3～144：转EDT1基因丹参阳性株.M：mark2000;1:Black control；2：Pecep control；3～144：Positive strain of transferring EDT1 gene Salvia miltiorrhiza.图5 转EDT1基因丹参的PCR检测Fgure 5 PCR detection of transferring EDT1gene Salvia miltiorrhiza

A为受体对照丹参植株，B、C、D、E为转EDT1基因丹参植株；1为干旱胁迫前的转EDT1基因丹参植株及受体对照丹参植株；2为干旱20d后的转EDT1基因丹参植株及受体对照丹参植株；3为复水后的转EDT1基因丹参植株及受体对照丹参植株.A.Receptor of EDT1gene Salvia miltiorrhiza，B、C、D、E.EDT1 gene Salvia miltiorrhiza;1.EDT1 gene Salvia miltiorrhiza plants and receptor plants before drought Stress;2.EDT1 gene Salvia miltiorrhiza plants and receptor plants of 20 days after drought stress;3.EDT1 gene Salvia miltiorrhiza plants and receptor plants after rewater.图6 转EDT1基因丹参抗旱性鉴定Figure 6 Identification of drought resistance of EDT1gene Salvia miltiorrhiza

3 讨论

丹参的遗传转化体系创建，已取得一些成熟的研究成果.常用的转化方法是以叶片和叶柄为外植体，采用MS+6-BA+NAA作为诱导愈伤组织的培养基,并以头孢霉素作为除菌培养抗生素.本研究比较了以叶柄、叶片和茎段分别作为外植体的转化效率，以及不同农杆菌液浓度和浸染时间对转化效率的影响，最终确定了以14 d叶龄叶柄为外植体，农杆菌液浓度D600=0.4 浸染15 min，MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA 愈伤诱导培养基为基本条件的丹参转化体系[14-17].

丹参遗传转化受基因型限制不明显[18-20],报道的受体品系也比较多.目前报道的丹参转化以叶盘为外植体的较多，多数研究者的研究结果表明叶片比叶柄转化效率更高，而上海师范大学周伟的研究表明，28 d叶龄的丹参叶柄比叶片的分化效率更高，更容易成芽[21-24].本研究以14 d叶龄的叶柄、茎段和叶片为外植体，结果表明以叶柄为外植体比叶片和茎段有明显优势，表现在分化率高，分化速度较快.不同外植体的分化效率可能与丹参叶龄有关，当丹参叶龄在7～14 d时，叶片的分化效率较高，当叶龄超过14d至28d甚至更长时，叶柄的分化效率较高.无论叶龄大小，以叶柄为外植体在浸染过程中更易于操作，相比之下，叶片难以剪切，放置时间稍长会萎蔫卷曲.在后期培养中，叶片四周容易翘起脱离培养基，造成农杆菌清除困难[25-27].

EDT1基因是中国科技大学向成斌教授从拟南芥耐旱突变体edt1中分离克隆得到的，在野生型拟南芥和烟草中过表达EDT1基因不但显著增强抗旱性与改良根系构型,还显著提高光合效率和水分利用率[28].EDT1基因被转入玉米、水稻、棉花中，获得了抗旱性显著提高的种质材料[29].在干旱胁迫下，本研究获得的转EDT1基因再生丹参植株叶片及根系生长明显优于受体对照，抗旱能力明显提高.