响应面法优化黑莓精粉超声提取工艺及其抗氧化活性研究

唐潇冉，周欣，龚小见，赵超

(贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，喀斯特山地生态环境保护与资源利用协同创新中心，贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，天然药物质量控制研究中心，贵州 贵阳 550001)

黑莓(RubusfruticosusL.)为蔷薇科悬钩子属多年生藤本植物，原产于北美，1986年由中国科学院植物研究所首次从美国引入[1].黑莓因富含大量天然活性物质，尤其是花青素，而备受消费者喜爱.花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素[2]，具有抗炎[3]、保护心血管[4]、防衰老[5]、抗氧化[6]、抗肿瘤[7]等作用，被广泛应用于食品、药品、保健品、化妆品等行业.

现有研究较多的是黑莓籽油[8]、黑莓渣[9]和黑莓汁[10-11]以及显著的生物活性等.Caillot等[12]研究发现黑莓酒中分离的多糖具有很好的抗炎作用；De Gomes等[13]研究发现黑莓汁花青素对顺铂诱导的小鼠肾损伤具有保护作用；Gowd等[14]研究发现黑莓经胃肠消化和肠道微生物发酵后抗氧化活性增强，并具有潜在的抗糖尿病活性；Tatar等[15]研究发现黑莓提取物能通过抑制人结直肠癌细胞端粒酶活性发挥抗癌作用.

黑莓具有诸多药理活性，但由于黑莓鲜果不耐保存，目前的加工产品主要有黑莓酒、饮料、果酱和黑莓粉等.黑莓粉可以在保存天然风味物质的同时延长保存周期，是一种黑莓深加工利用的有效途径，可添加在固体饮料、保健品、食用薄膜等产品中.Gislaine等[16]将黑莓粉添加在箭根淀粉的可食用薄膜中以改善薄膜的厚度、颜色、水溶性、透水性、花青素含量和抗氧化性能等理化性质；朱泓等[17]对黑莓冻干果粉进行研究发现其具有很好的抑菌抗炎活性；张丽霞等[18]以出粉率和含水量为指标通过喷雾干燥工艺制备黑莓粉，并进行了工艺参数优化.目前黑莓粉多采用对黑莓浆直接喷雾干燥制备，但该方法对产品的花青素等天然风味物质损失较大，对黑莓利用率不高[19-20].本研究以黑莓作为主要研究对象，应用真空冷冻干燥技术制备黑莓精粉，并采用响应面法优化其超声提取工艺，并对其体外抗氧能力进行测定，以期为黑莓的综合利用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑莓，产地为山东莱阳；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，东京化成工业株式会社；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品，宝鸡市辰光生物技术有限公司；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，笛医生物科技有限公司；过硫酸钾、抗坏血酸、甲醇、盐酸、无水乙醇等均为分析纯.

1.2 仪器与设备

Spectra Max Plus 384酶标仪，美国Molecular Device公司；R-200旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；FD-1D-80真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；KQ-300DE数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 黑莓精粉的提取工艺用料理机将黑莓打碎匀浆，准确称取黑莓浆3.00 g于250 mL具塞锥形瓶中，按1∶25的料液比(g/mL)加入蒸馏水，超声提取30 min，离心后过滤，取滤液经真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩液置于已干燥至恒质量的蒸发皿中，冷冻24 h后经真空冷冻干燥机干燥24 h，即得到黑莓精粉.

1.3.2 花青素含量的测定 以不同浓度的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷做标准曲线进行分析测定[21].标准曲线方程为：Y=0.001 8X-0.001(R2=0.999 0，线性范围43～430 μg/mL).同法测定黑莓精粉中花青素的含量，按照标准曲线计算质量浓度，按公式(1)计算.

(1)

式中：C为样品溶液中花青素的质量浓度，μg/mL；V为溶液定容体积，mL；N为稀释倍数；M为精粉称取的质量，g.

1.3.3 精粉得率的计算 参考文献[22]所描述的方法稍作修改计算精粉得率.将提取的滤液置于真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩液于已干燥至恒质量的蒸发皿中放入冰箱中，冷冻24 h后经真空冷冻干燥机进行干燥24 h，放置室温后称量，按照公式(2)计算.

(2)

式中：M为黑莓浆的质量，g；M1为蒸发皿的质量，g；M2为蒸发皿和精粉干燥后的总质量，g.

1.3.4 单因素试验参考文献方法[2,23]，在超声时间30 min，超声功率120 W，料液比(g/mL) 1∶25的基础条件下，保持其他因素不变，只改变其中一个因素，设置料液比( g/mL) 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，提取时间10、20、30、40、50 min，超声功率120、180、240、300 W，以黑莓精粉得率及花青素含量为指标，每组试验重复3次进行单因素试验.

1.3.5 响应面试验设计 在单因素试验结果的基础上，Box-Behnken试验选取提取时间(A)、提取功率(B)和料液比(C) 3个自变量，以精粉得率和花青素含量的总评归一值(OD)为评价指标，设计三因素三水平响应面试验.试验的因素与水平见表1.

表1 响应面试验设计因素水平表Table 1 Variables and levels in the response surface methodology

根据Hassan[24]的方法对精粉得率和花青素含量两个指标进行归一化计算，见公式(3).

di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

(3)

式中：Yi为实测值，Ymax和Ymin为各指标在不同组试验中检测所得的最大值和最小值.根据上述公式计算出各指标的di值后，计算总评归一值OD=(d1×d2×…×dk)1/k，k为指标数.

1.3.6 体外抗氧化活性检测

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的测定 参照文献[25-26]的方法略作修改，具体为：准确称取9.87 mg DPPH，用无水乙醇溶解，定容至100 mL，得到0.25 mmol/L溶液.取0.5 mL不同浓度的黑莓精粉溶液和抗坏血酸对照品溶液分别与0.5 mL浓度为0.25 mmol/L DPPH乙醇溶液混合，摇匀，室温下避光反应30 min，测定其在517 nm处的吸光值(Ai)，各平行测定3次.以等体积无水乙醇代替DPPH乙醇溶液为对照(Aj)，等体积蒸馏水代替样品溶液为空白(A0)，将测得数据带入下列公式(4)计算DPPH自由基清除率：

(4)

1.3.6.2 ABTS自由基清除能力的测定 参照文献[27-28]的方法略作修改，具体操作为：准确称取77.03 mg ABTS和13.40 mg过硫酸钾，分别用蒸馏水溶解，定容至10 mL，两种溶液按1∶1比例混合后室温下避光反应12～16 h，得到 ABTS自由基储备液.使用前稀释储备液，使其在734 nm处吸光度为0.70±0.02.取0.4 mL不同浓度的样品溶液和抗坏血酸对照品溶液分别与0.8 mL ABTS自由基溶液混合，摇匀，室温下避光反应20 min，测定其在734 nm处吸光值(Ai)，各平行测定3次；以等体积水代替ABTS溶液为对照(Aj)测定吸光度，以等体积蒸馏水代替样品溶液为空白(A0)测定吸光度，将测得数据带入公式(5)计算ABTS自由基清除率：

(5)

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及分析

2.1.1 料液比对黑莓精粉得率和花青素含量的影响 由图1可知，随着料液比的增加，黑莓精粉的得率和花青素含量显著升高(P<0.05)，料液比(g/mL)为1∶25时，精粉得率和花青素含量达到最高；当料液比高于1∶25 (g/mL)时，精粉得率和花青素含量均略有降低，但无显著性差异(P>0.05).可能是因为料液比增加时增大了溶剂和黑莓中花青素质量浓度差异，传质推动力大，有助于花青素的溶出[29]，促进精粉的提取；但花青素在一定量溶剂下已经全部溶解，继续增加溶剂体积不再促进花青素的溶出，反而可能促进杂质的溶出，降低花青素含量[23].因此，选择1∶25作为提取的最佳料液比.

小写字母不同表示差异显著(P<0.05).Different letters indicate the significant differences(P<0.05).图1 料液比对精粉得率和花青素含量的影响Figure 1 Effects of solid-to-liquid ratios on powder yield and anthocyanin content

2.1.2 超声时间对黑莓精粉得率和花青素含量的影响 如图2所示，随着超声时间的增加，黑莓精粉得率和花青素含量逐渐增加(P<0.05)，超声时间为30 min时，精粉得率和花青素含量达到最高，大于30 min后精粉得率和花青素含量逐渐下降.可能原因是适当增加提取时间有助于细胞充分破碎，促进黑莓花青素的溶解，但超声时间增长使溶液温度升高，会使热敏性的花青素变性、分解[29-30]，降低花青素质量浓度，精粉得率也随之降低，但变化不显著(P>0.05).因此，选取30 min为最佳超声时间.

小写字母不同表示差异显著(P<0.05).Different letters indicate the significant differences(P<0.05).图2 超声时间对精粉得率和花青素含量的影响Figure 2 Effects of ultrasonic time on powder yield and anthocyanin content

2.1.3 超声功率对黑莓精粉得率和花青素含量的影响 如图3所示，随着超声功率的逐渐增加，精粉得率和花青素含量呈先增后降的趋势，超声功率为180 W时精粉得率和花青素含量最高.可能是由于随着超声功率增加，超声波的机械作用和空化效应能力增加，造成黑莓细胞壁破坏，促进了精粉提取和花青素溶解；但当功率大于180 W时，高强度的空化作用破坏花青素结构，使花青素含量减少，降低精粉得率[31]，不利于黑莓精粉的提取，因此选择180 W为最佳提取功率.

小写字母不同表示差异显著(P<0.05).Different letters indicate the significant differences(P<0.05).图3 超声功率对精粉得率和花青素含量的影响Figure 3 Effects of ultrasonic power on powder yield and anthocyanin content

2.2 响应面试验结果及分析

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken设计原理，以超声时间(A)、超声功率(B)和料液比(C)3个因素作为自变量，以精粉得率和花青素含量的总评归一值(OD)为响应值，采用响应面法进行三因素三水平的响应面分析，研究各因素对提取黑莓精粉影响的显著性和各因素的最佳组合，试验设计方案及结果见表2.

2.2.1 方差分析及回归模型的拟合分析 结合表2结果，利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行处理，得到OD值与单因素超声时间(A)、超声功率(B)和料液比(C)的二次方程模型.

表2 Box-Behnken 试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

OD=0.81+0.045A-0.12B+0.17C+0.012AB-0.023AC-0.12BC-0.033A2-0.30B2-0.25C2

从表3可以看出，该回归方程的一次项B、C差异显著，且C为极显著，表明料液比(C)的影响较大；交互项差异不显著，二次项B2、C2差异极显著.在所选取的各因素水平范围内，A、B、C这三因素对黑莓精粉提取的影响顺序为：C>B>A，即料液比>超声功率>超声时间.

表3 响应面二次回归模型方差分析结果Table 3 Result of ANOVA for response surface quadratic regression model

2.2.2 响应面分析 各因素交互作用对黑莓精粉得率和花青素含量影响的响应曲面图如图4所示.响应面坡度平缓说明因素间的交互作用较弱，即试验条件的改变对响应值影响不大；反之则表明因素间的交互作用强，对响应值影响大.等高线图呈椭圆形表明因素的交互作用，而圆形则相反，表明两因素的交互作用对响应值影响不大[31].结合表3中数据可知，超声时间、料液比对OD值均有显著影响.各因素对响应值的显著性表现为：料液比>超声功率>超声时间.图4中响应面坡度都比较平缓，说明其超声时间、超声功率和料液比之间的交互作用对OD值的影响不显著.

图4 各因素交互作用的响应面Figure 4 Response surface diagrams of interaction of various factors

2.2.3 确定最佳工艺参数与模型验证 通过响应面回归模型分析得到黑莓精粉的最佳提取工艺条件为：提取时间30.79 min，提取功率164.49 W，料液比(g/mL)1∶27.02，OD的理论预测值为0.859 2.考虑操作的可行性，对上述工艺条件进行修正，最佳条件为：提取时间30 min、提取功率180 W、料液比(g/mL)1∶27.在此修正条件下进行试验验证，结果显示：精粉得率为(9.22±0.07)%，花青素含量为(11.21±0.32)mg/g，OD值为0.875 1，与理论预测值相近，表明利用响应面分析法得到的黑莓精粉提取工艺参数真实可靠，具有实用价值.

2.3 黑莓精粉体外抗氧化活性分析

2.3.1 黑莓精粉清除DPPH自由基的能力 由图5可知，当样品质量浓度在0.01～0.60 mg/mL时，黑莓精粉对DPPH自由基具有较好的清除能力，且与其质量浓度呈显著的量效关系，当质量浓度为0.60 mg/mL时，清除率达到(92.56±0.12)%.在试验设计质量浓度范围内，黑莓精粉对DPPH自由基的清除能力稍弱于抗坏血酸，IC50为(0.10±0.01)mg/mL.

图5 黑莓精粉对DPPH自由基的清除能力Figure 5 DPPH free radical scavenging activity of blackberry powder and ascorbic acid

2.3.2 黑莓精粉清除ABTS自由基的能力 如图6所示，当样品质量浓度在0.02～0.60 mg/mL时，黑莓精粉对ABTS自由基的清除能力随着质量浓度的增大而增加，存在显著的量效关系，当质量浓度为0.60 mg/mL时，清除率达到(75.86±0.28)%.黑莓精粉对ABTS自由基清除率的IC50为(0.19±0.05) mg/mL，清除能力弱于抗坏血酸.

图6 黑莓精粉对ABTS自由基的清除能力Figure 6 ABTS free radical scavenging activity of blackberry powder and ascorbic acid

3 讨论

超声提取是提取植物花青素的常用方法，具有花青素得率高、操作简便、耗时短等优点[32].果粉的干燥方式主要有真空冷冻干燥、喷雾干燥、热风干燥、远红外干燥等.不同干燥方式对蓝莓[33]、桑葚[34]、樱桃[35]果粉影响的研究结果表明，真空冷冻干燥能较好地保留果粉中花青素等天然活性成分，果粉品质高.黑莓属于热敏性物料，加热时会造成天然活性成分损失，因此本研究采用真空冷冻干燥方式制备黑莓精粉.

本试验考察了超声功率、超声时间和料液比对黑莓精粉中花青素含量和精粉得率的影响，在此基础上利用响应面试验优化黑莓精粉提取工艺，建立的回归模型和现实拟合度较高，表明方法稳定可靠.徐怀德等[36]通过响应面试验得出各因素对原花青素得率的影响顺序为料液比>超声功率>超声时间，与本试验结果相吻合.响应面优化后最佳工艺条件下精粉得率为(9.22±0.07)%，花青素含量为(11.21±0.32)mg/g，而陈力宏等[37]采用正交试验优化黑莓果花青素的提取工艺，黑莓花青素含量为0.303 mg/g，Braga等[38]采用喷雾干燥的方式制备的牛奶黑莓粉，花青素含量为(568.6±3.4)μg/g，均低于本研究中黑莓精粉的花青素含量.

黑莓花青素具有抗氧化活性，黑莓产品也具有良好的清除氧自由基的能力，尹震花等[8]研究黑莓籽油的化学成分发现黑莓籽油具有清除ABTS自由基(IC50为214.64 mg/L)和还原铁离子(Trolox当量(22.53±2.92)μmol/g)的能力.汪洪涛等[10]采用响应面法优化了黑莓渣中抗氧化物质提取工艺，结果显示，得出最优条件下提取液的抗氧化能力为15 228.8 unit/g.本研究制得的黑莓精粉对DPPH和ABTS自由基均具有较好的清除能力，且在一定范围内，清除能力随质量浓度增加而增加，其IC50分别为(0.10±0.01)mg/mL和(0.19±0.05)mg/mL.

4 结论

本研究得到的黑莓精粉最佳粗提条件为：超声时间30 min、超声功率180 W、料液比(g/mL)1∶27，在此工艺条件下，精粉得率为9.22%，花青素含量为11.21 mg/g.与理论预测值相近，表明利用响应面法优化黑莓精粉超声提取工艺条件切实可行，操作简单便捷，精粉得率和花青素含量高，具有实用价值.黑莓精粉对DPPH自由基和ABTS自由基清除的IC50值分别为0.10 mg/mL和0.19 mg/mL，具有一定的抗氧化能力，可以作为一种天然抗氧化剂开发，在功能食品和药品方面具有较好的开发前景.