复方中草药对肉鸡生长性能及天然免疫相关基因mRNA表达的影响

2021-03-15高强贾绥安杜宝龙薛瑞林唐德富李守湖柳纪省

甘肃农业大学学报 2021年1期

高强，贾绥安，杜宝龙，薛瑞林，唐德富，李守湖，柳纪省

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070；2.兰州威特森生物科技有限公司，甘肃兰州 730070)

近年来，肉鸡养殖中抗生素的滥用导致致病菌的耐药性越来越强，兽药残留造成鸡肉食品安全问题受到消费者的密切关注，随着2020年无抗禁令的实施，我国肉鸡养殖进入无抗养殖时代，替抗产品的研究成为新的热点，中草药制剂、酶制剂、微生态制剂、植物精油等均被认为是潜在的替抗产品[1].中草药作为一种绿色添加剂广泛应用于畜牧养殖业，其生物活性物质能够促进动物健康生长，使畜禽机体内环境保持平衡状态[2].而且中草药具有毒副作用小、促进生长、促进动物新陈代谢、无耐药性、提高饲料报酬、预防疾病等优点[3]，它克服了化学合成药物毒副作用大的缺点，是新一代安全性能较好的饲料添加剂[4-5].

中草药应用于家禽已被国内外学者进行了大量研究，多数研究结果表明，在饲粮中添加不同配方的复方中草药，可以提高肉鸡的生长性能、免疫功能以及肉品质[6-7]，同样促进育肥猪的增重速度并改善肉品质[8].但是中草药具有配伍不相容、用量大、作为添加剂使用缺乏统一的质量检验标准等缺点，复方中草药调节机体免疫功能的作用机制认识尚不清楚，还需进一步研究和探讨[9].本试验旨在评估复方中草药对肉鸡生长性能、免疫器官发育指数及天然免疫相关基因mRNA表达的影响，为复方中草药在家禽生产中的应用以及替代抗生素的可行性提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用复方中草药由兰州威特森生物科技有限公司提供，主要成分为女贞子、板蓝根、当归、柴胡、丹参、黄芪.肉鸡为科宝505白羽肉鸡，购自陕西宝鸡大成禽业有限公司.RNA提取试剂盒购自美国纽英伦生物技术公司(NEB)，SYBR qPCR SuperMix购自近岸科技有限公司，RNA反转录试剂盒购自瑞士罗氏制药有限公司，其他化学试剂均购自美国SIGMA生物科技有限公司.

1.2 试验设计

本试验采用单因素完全随机设计，选择1日龄健康‘白羽肉鸡’504只，按照组平均体质量相近原则分为7组，每组6个重复，每个重复12只鸡，公母各半，分别饲喂基础饲粮(对照组，A组)、基础饲粮+抗生素(0.48 g/kg氟苯尼考，1～42 d，B组)、基础饲粮+100 mL/kg复方中药制剂提取物(C组，14～42 d)、基础饲粮+100 mL/kg复方中药制剂提取物(D组，21～42 d)、基础饲粮+10 g/kg复方中药粉末制剂(E组，14～42 d)、基础饲粮+10 g/kg复方中药粉末制剂(F组，21～42 d)、基础饲粮+20 g/kg复方中药粉末制剂(G组，14～42 d).饲养期为42 d，分前期(0～21 d)和后期(22～42 d)2期进行.

1.3 试验饲粮

基础饲粮组成见表1，营养参数参考农业行业标准NY/T33-2004配制.配方计算时，原料中干物质、粗蛋白、粗脂肪、有机物、钙和总磷的含量均采用实测值，其他指标参考中国饲料成分及营养价值表(2017年第28版).试验提供粉料饲喂肉鸡.

表1 基础饲粮配方组成及营养水平(风干基础，%)Table 1 Composition and nutrient level of basal diets(air dried basis，%)

1.4 饲养管理

试验肉鸡饲养管理参照《科宝肉鸡饲养管理手册》.采用3层立体叠笼饲养，自由采食和饮水，日饲喂3次.试验期内保持鸡舍内正常通风，按常规免疫程序进行免疫，每日巡栏观察鸡群精神状态和采食情况，早晚各消毒1次，保持鸡舍内外空气清洁卫生.

1.5 样品采集

1.5.1 血液样品采集分别于21、28、35、42 d以重复为单位，在A组和D组中每笼抽取与平均体质量接近的2只鸡(公母各1只)采集翅下静脉全血，混合后-20℃保存，饲养试验结束后带回实验室用于细胞因子的检测.

1.5.2 免疫器官的采集 42日龄，以重复为单位每笼抽取与平均体质量接近的2只鸡(公母各1只)，称其活质量，屠宰解剖后立即分离胸腺、脾脏、法氏囊，用滤纸吸去血渍，剔除脂肪组织后称鲜质量，并计算免疫器官指数.

1.6 测定指标与方法

1.6.1 生长性能及免疫器官指数在肉鸡饲养第0、21、42天时，分别以重复为单位对鸡称质量及统计余料量，计算平均日采食量(AFI)、平均日增质量(ADG)、料质量比(F/G)以及免疫器官指数.

1.6.2 细胞因子测定以β-actin基因作为内参基因，实时荧光定量测定肉鸡血液中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TLR-3、TLR-4基因的mRNA相对表达量.

1.6.2.1 全血RNA的提取及cDNA的合成将带回实验室的血样解冻后立即提取全血RNA并进行反转录，具体步骤依照Quick-RNATM Whole Blood Catalog NoS.R1201试剂盒及反转录试剂盒说明进行.

1.6.2.2 引物的合成根据GenBank数据库中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TLR-3、TLR-4和β-actin的基因序列，利用primer 5软件设计引物，详细序列信息见表2，所有引物序列均由武汉金开瑞生物工程有限公司进行合成.

表2 免疫因子及内参引物序列Table 2 Immune factors and internal reference primer sequences

1.6.2.3 荧光定量PCR 根据TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行反应，每个样品的目的基因和内参基因分别进行扩增，每样3个重复.反应体系共20 μL：cDNA样2 μL；Universdl SYBR Green 10 μL；上、下游引物各1.5 μL；Free Water 5 μL.扩增条件的程序设置：98℃ 2 min；95℃ 10 s，60℃ 45 s 循环40次；90℃ 90 s；60℃ 3 min；94℃ 10 s.PCR反应结束后，使用PCR仪自带的ABI7300 SDS Software分析软件分析所得结果Ct值.目的基因的mRNA相对表达量用2-△△Ct计算，最终结果以GraphPad Prism 5软件作图表示.

1.7 统计分析

试验数据均用Excel 2013软件进行整理，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，差异显著时用Duncan氏进行多重比较，P<0.05为差异显著性判断标准.

2 结果与分析

2.1 复方中草药对肉鸡生长性能的影响

由表3可见，试验前期(0～21 d)，B组肉鸡平均日采食量显著高于A组和F组(P<0.05)，且其平均日增质量显著高于除C组和E组外的其他各组(P<0.05).试验后期(22～42 d)，C组肉鸡平均日采食量和平均日增质量均显著高于A组和E组(P<0.05)，B组肉鸡平均日增质量显著高于A组、E组和F组(P<0.05).从全期(0～42 d)看，各处理组肉鸡平均日采食量无显著性差异(P>0.05)，但B组肉鸡平均日增质量显著高于A组、D组和F组(P<0.05)，且C组、E组、G组肉鸡平均日增质量显著高于A组(P<0.05)，而A组肉鸡料质量比显著高于B组、C组和E组(P<0.05)，B组肉鸡料质量比显著低于D组和F组(P<0.05).

表3 复方中草药对不同生长阶段肉鸡生长性能的影响Table 3 Effects of compound chinese herbal medicine on growth performance of broilers at different growth stages

2.2 复方中草药对肉鸡免疫器官的影响

如表4所示，对于胸腺指数而言，B组显著高于除C组和E组外的其他各组(P<0.05)，而C组和E组显著高于A组(P<0.05).B组脾脏指数也显著高于除C组和E组的其他各组(P<0.05)，而C组、E组和G组均显著高于A组(P<0.05).各组间法氏囊指数均无显著性差异(P>0.05).

表4 复方中草药对肉鸡免疫器官的影响Table 4 Effects of compound Chinese herbal medicine on immune organs of broilers

2.3 复方中草药制剂对肉鸡血液细胞因子mRNA的影响

结果如图1所示，与对照组相比，试验组肉鸡血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3、TLR4基因的mRNA在试验期内均有上升趋势，而IL-10呈下降趋势.试验组IL-2、IL-8、TLR3、TLR4基因的mRNA在试验期内均显著高于对照组(P<0.05)，整体呈上升趋势；IL-6mRNA在28 d和35 d时显著高于对照组(P<0.05)，呈上升趋势；而试验组IL-10mRNA在28 d和42 d时均显著低于对照组(P<0.05)，呈下降趋势.总体来看，在饲粮中持续添加复方中草药可显著提高肉鸡血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3、TLR4mRNA表达量(P<0.05)，并显著降低血液IL-10mRNA的表达丰度(P<0.05).

图1 复方中草药对肉鸡血液细胞因子mRNA相对表达量的影响Figure 1 Effect of compound Chinese herbal preparations on relative expression of cytokine mRNA of blood by broilers

3 讨论

饲粮中添加复方中草药能有效提升肉鸡生产性能已被国内外多数试验所证实，多数养殖场接受并通过中草药添加剂来提升肉鸡生产性能[10].本试验前期结果显示，B组平均日增质量与平均日采食量均显著高于其他各组，再次证实了抗生素提高肉鸡生长性能的效果.后期B组平均日增质量和平均日采食量与C组、D组和G组均无显著性差异，表明饲粮添加复方中草药与添加抗生素对肉仔鸡的生长促进效果一致.全期结果显示各组平均日采食量均无显著差异，平均日增质量结果B组、C组、E组优于其余各组，但料质量比C组最低，其结果表明C组添加效果优于B组.唐日益等[11]研究复方中草药添加剂(HMA)对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响，分别以连续和隔周在基础饲粮中添加2 kg/t HMA为试验组，结果显示复方中草药添加剂对生产性能和蛋品质均有改善作用，且连续饲喂复方中草药添加剂效果较好，本试验结果与其相似.刘砚涵等[12]研究中草药饲料添加剂对‘北京鸭’生产性能、免疫指标及肉品质的影响，在基础饲粮中分别添加0.1%(低剂量组)、0.2%(中剂量组)及0.5%(高剂量组)的复方中草药，发现复方中草药显著提高北京鸭生长性能、屠宰性能，尤以0.2%的中草药添加量效果最好.本试验E组与G组各项生长性能检测指标均无显著差异，说明低剂量添加就可达到高剂量的添加效果.对于复方中草药的配伍及添加量还需更多有力数据支撑，复方中草药添加效果是否优于抗生素还需后续试验进行考证.

禽类的免疫器官主要有法氏囊、胸腺和脾脏，其中法氏囊和胸腺是禽类的中枢免疫器官，脾脏是禽类的次级免疫器官[13].免疫器官的发育状态和功能直接决定着家禽的免疫水平，其良好的发育能有效降低肉鸡的发病率，减少药物的使用，保证肉制品的质量和安全.女贞子所含的路类及苯芒醇巧类物质具有补肝补肾、清虚热的作用；板蓝根当中所含有的黄酬类和三瞄皂巧类生物活性物质具有清热解毒的作用；当归中含有的当归多糖和挥发油具有补血活血、润燥滑肠作用；柴胡中所含的皂苷能抑制各种炎症因子引起的踝关节肿胀和结缔组织增生性炎症[14].将其加入肉鸡基础饲粮，可有效改善肉鸡免疫器官的发育.蔡晴霞等[15]比较4种复方中药添加剂对肉鸡生产性能与免疫性能的影响，4个试验组以拌料法和饮水法给药，测定不同日龄肉鸡免疫器官指数，结果显示复方中药2组可提高脾脏指数和胸腺指数，其结果与本试验结果基本一致.杨润霞等[16]研究3种中药复方制剂对雏鸡免疫器官发育及免疫功能的影响，以黄芪、白术、防风等单味中药组成3组中药复方中草药制剂，分别于42、52、62日龄对试验鸡进行检测，结果显示，试验组雏鸡胸腺、法氏囊发育良好，无明显衰老症状.其结果与本试验存在差异，可能与中草药配方、基础饲粮组成及营养水平、饲养环境不同等因素密切相关[17].总体而言，复方中草药对肉鸡免疫器官的发育有促进作用.

IL-2又称T细胞生长因子，可以激活T细胞，促进B细胞增殖和抗体分泌以及巨噬细胞的活化[18].IL-6主要能刺激活化的B细胞增殖和分泌抗体，刺激肝细胞合成急性期蛋白并参与炎症反应，促进血细胞的发育[19].IL-8的主要生物学活性是吸引和激活中性粒细胞.中性粒细胞与IL-8接触后发生形态变化，迁移到反应部位，释放出一系列活性产物.这些作用可导致机体局部炎症，达到杀菌和细胞损伤的目的[20].IL-10可通过活化的T细胞抑制细胞因子的产生，因此被称为细胞因子合成抑制剂(cytokine synthesis inhibitor，csif)，特别是通过TH1细胞抑制IL-2、IFN-、LT等细胞因子的产生，从而抑制细胞免疫应答[21].TLR3信号通路可促进炎性因子的产生，在宿主抵抗活性病毒中发挥重要作用[22].TLR4受体在多种细胞中均有表达，例如单核巨噬细胞、中性粒细胞等[23].TLR可识别病毒囊膜蛋白，然后与病原分子结合，从而启动机体免疫系统，最终引起趋化因子和炎症因子的表达而发挥抗感染作用[24].寡糖、植物精油和微生态制剂可调节肉鸡体内部分基因IL及TLRsmRNA的表达已被多位学者早期证实，但目前关于复方中草药对肉鸡天然免疫相关基因表达的影响报道较少[25].马景番等[26]探讨不结球白菜提取物(NCCE)对肉鸡脾脏细胞因子mRNA表达丰度的影响，分别在基础饲粮中添加不同剂量的 NCCE，结果显示，与对照组相比，NCCE能够诱导肉鸡脾脏IL-2、IL-4及IFN-γmRNA的表达，以添加500 mg/kg效果最好.熊阿玲等[27]探讨不同水平的MOS对肉鸡生长性能等的影响，天然免疫相关基因表达检测结果显示，饲粮添加MOS显著影响肉鸡组织TLR2和TLR4mRNA的表达.本试验在基础饲粮中持续添加复方中草药，肉鸡血液中IL-2、IL-6、IL-8、TLR3和TLR4基因mRNA的表达量显著高于对照组，并在试验期内呈显著上升趋势，且IL-10mRNA表达显著下降，进一步说明了中草药制剂也同样具有增强免疫的功效.