复方中草药制剂抑菌作用及其对湖羊部分细胞因子mRNA表达的影响

2021-03-15薛瑞林高强李守湖柳纪省马友记

甘肃农业大学学报 2021年1期

薛瑞林，高强，李守湖，柳纪省，马友记,3

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070；2.兰州威特森生物科技有限公司，甘肃兰州 730030；3.甘肃省肉羊繁育生物技术工程实验室，甘肃民勤 733300)

随着我国养羊业逐步向集约化、规模化方向发展，养殖方式和养殖规模转变，羊群运动量减少，加之饲养管理方面的不足，乳房炎已经成为影响养羊业发展的重要因素之一[1-2].目前，使用抗生素仍然是国内外防治乳房炎的主流方法，但不管是传统的对抗法还是以MIC为基础获得最佳疗效的顺势法，本质都是抗生素疗法，难免产生耐药性[3]，加之临床上抗生素的不合理使用，甚至导致细菌产生多重耐药性，在造成企业养殖成本大大增加的同时，乳中大量药物残留也时刻威胁人类的健康[4].因此，及时准确的掌握养殖场乳房炎病原菌的种类和耐药性情况，并筛选有效治疗乳房炎的药物以代替抗生素进行临床上乳房炎的治疗是控制乳房炎的关键.

中草药作为一种传统的“天然药材”，因其副作用小、无毒无残留、不易产生耐药性而成为近年来治疗乳房炎的热门选择[5].研究发现，中药可以促进畜禽正常免疫器官发育，增强和恢复免疫功能，促进淋巴细胞增殖，促进和调节细胞免疫和体液免疫，促进多种细胞分泌细胞因子，对动物机体有很好的免疫促进作用[6].本研究就使用复方中草药制剂，通过体外抑菌实验和药物注射实验，检测该制剂对乳房炎3种病原菌的抑菌效果及其对湖羊体内IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等7种细胞因子mRNA表达量的影响，以期为该制剂在临床上的应用提供试验基础，对临床上减少抗生素的使用，促进畜牧业绿色无抗生产提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 材料

菌株为本实验室从患有临床乳房炎湖羊乳样中分离得到菌株；牛津杯(6×8×10 mm)，购自北京博纳瑞生科技有限公司；复方中草药制剂由兰州威特森生物科技有限公司自主研发和提供；RNAprep pure Blood Kit试剂盒，购自北京天根生物生化科技公司；Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，购自Promega公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒，均购自TaKaRa公司；Applied Biosystems Quant Studio 3实时荧光定量PCR仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；10只年龄、胎次、健康状况相近的预产期湖羊由武威普康养殖有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 菌液和中草药制剂的制备取纯化培养后的菌株划线于普通肉汤培养基上，37 ℃温箱培养12～16 h后，挑取单菌落接种于营养肉汤，37 ℃、200 r/min培养12 h，利用平板菌落计数法对3种菌进行计数，调整菌液的终浓度为106CFU/ mL，标记后备用.

复方中草药制剂主要成分为白头翁、板蓝根、柴胡、丹参、黄芪、当归.该药品经离心、过滤和浓缩的预处理，使得生药含量为1.0 g/mL.离心后，取上清液用试管二倍稀释法稀释至500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL等6个浓度梯度，121 ℃高压灭菌，标记后4 ℃保存以进行体外抑菌试验.

1.2.2 体外抑菌试验吸取0.1 mL制备好的菌悬液，滴入事先准备好的经过高压灭菌的普通营养琼脂平板内，使用涂布器涂匀.参照陈薇[7]的方法，放置牛津杯，再用滴管往牛津杯中按浓度由大到小依次加入0.2 mL制备好的不同浓度中草药制，盖上平皿盖.然后将滴加药液的平皿水平置于恒温箱内，37 ℃恒温培养18～24 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径.结果判定标准：抑菌圈直径小于10 mm为耐药；10 mm～15 mm为中度敏感；大于15 mm为高度敏感[8].

1.2.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定复方中草药制剂对3种乳房炎病原菌最小抑菌浓度(MIC)的测定参考柯文杰等[9]的方法进行：将已二倍稀释的复方中草药制剂按浓度梯度依次分装至试管，每个试管2 mL.再往每个浓度梯度试管中分别加入100 μL菌液，每个样品做3个重复.同时每个梯度组设1支不含复方中草药制剂只含等量菌液的阳性对照管以及1支不含菌液只含复方中草药制剂的阴性对照管.37 ℃恒温培养16～18 h.肉眼观察无细菌生长时的最低药物浓度为该药的MIC.

1.2.4 最小杀菌浓度(MBC)的测定复方中草药制剂对3种乳房炎病原菌最小杀菌浓度(MBC)的测定参考聂鲡蓉等[10]的方法进行：从每种细菌的MIC和高于MIC浓度的各试管中分别吸取100 μL培养物，接种于营养琼脂培养基，37 ℃恒温培养48 h，肉眼观察无菌落生长的最低复方中草药制剂浓度即为最小杀菌浓度.

1.2.5 药物注射及血样采集将母羊随机分为试验组和对照组，每组5只.母羊分娩当天记为第0天，试验期28 d.试验组母羊分别在分娩后1、4、7 d按5 mL/只肌肉注射复方中草药制剂，对照组母羊不作处理.随机选取试验组和对照组母羊各3只分别在用药前和用药结束后第1、3、7、14、21 d使用抗凝的采样管颈部静脉采集3 mL全血血样，标记并冷冻保存.

1.2.6 血液中RNA的提取及cDNA的合成按RNAprep pure Blood Kit试剂盒说明书步骤提取血样中RNA，每个样品重复提取3次，定量后按照Thermo ScientificTMRevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行反转录.cDNA置于-20 ℃保存待用.

1.2.7 细胞因子mRNA相对表达量的测量采用实时荧光定量PCR法检测IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的mRNA相对表达量.按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行RT-PCR反应.以β-actin作为内参，用Ct(△△Ct)法来处理RT-PCR结果，计算结果用2-△△Ct表示.各细胞因子及β-actin的mRNA引物序列由Primer Premier 5.0设计并检测，引物信息见表1.

表1 细胞因子及内参引物序列Table 1 Primer sequences of cytokines and internal reference genes

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 复方中草药制剂药敏试验

使用不同浓度中草药制剂进行抑菌试验，每株菌同一药物浓度做3次重复，用游标卡尺测量抑菌圈直径，取平均值(表2).结果显示，该中草药制剂对于3种乳房炎病原菌均有较强的抑杀作用.当药物浓度为1 g/mL时，3种病原菌抑菌圈均在20 mm以上，并且药物浓度相同的情况下，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径普遍大于其他2种细菌.

表2 复方中草药制剂耐药实验结果及判定Table 2 Resistance test results and determination of compound Chinese herbal medicine preparations

2.2 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

复方中草药制剂对肠球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验结果表明，该制剂对3种乳房炎病原菌的MIC依次分别为125、125、62.5 mg/mL，MBC分别为250、125、125 mg/mL.

2.3 细胞因子mRNA相对表达量

采用RT-PCR技术检测得到湖羊外周血中细胞因子mRNA相对表达量，结果如图1所示.与对照组相比，湖羊外周血中IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ mRNA表达量在试验期内均表现为上升趋势.上述细胞因子中，除IFN-γ在第1 天表达量增加不显著(P>0.05)，IL-2和IL-12在第21 天表达量增加不显著(P>0.05)外，其余细胞因子mRNA表达量在试验期内均显著上升(P<0.05或P<0.01).而在整个试验期内，IL-6和TNF-α的mRNA表达量下降，与对照组相比差异显著(P<0.05或P<0.01).

3 讨论

3.1 复方中草药制剂的抑菌作用

本试验所用的菌株均从患临床型乳房炎湖羊乳中分离鉴定得到，其中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均为常见的乳房炎高致病菌，而粪肠球菌也是常见的乳房炎病原菌[11-12]，用复方中草药制剂对这3种病原菌做药敏测定，其结果对临床试验更具有参考意义.许多研究表明，中药及其提取物可以直接杀灭病原菌或通过多种途径提高机体免疫力达到防治疾病的效果[13-14].本研究采用相比于醇提法操作更为简单、成本更为低廉的水提法提取白头翁、柴胡、黄芪、当归等6味中草药的有效成分，进行乳房炎病原菌的体外抑菌试验.抑菌结果显示，复方中草药制剂对引起湖羊乳房炎的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌均有良好的抑制作用，对金黄色葡萄球菌抑制作用最强.与金兰梅[15]研究结果基本一致.从本试验研究可以认为该制剂对湖羊乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌均有很好的抑杀作用，对临床上使用中草药制剂防治湖羊乳房炎、筛选对乳房炎病原菌有良好抑杀作用的中草药物进行防治湖羊乳房炎的兽药研发具有一定的指导意义.

同一日龄不同处理组相比，* 表示差异显著(P<0.05)；** 表示差异极显著(P<0.01).Among different groups in the same day age，* indicate significant difference(P<0.05)；** indicate extremely significant difference(P<0.01).图1 湖羊外周血中IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ在用药前和用药后的mRNA相对表达量Figure 1 The relative mRNA expression of IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，TNF-α and IFN-γ before and after medication in peripheral blood of Hu sheep

3.2 复方中草药制剂对细胞因子的mRNA相对表达量的影响

细胞因子是由活化的免疫细胞和非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有多种生物活性的小分子蛋白质[16].可被分为白细胞介素、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趋化因子、生长因子等，具有间接反应动物细胞免疫功能的作用[17].而中草药成分丰富，富含糖类、皂苷类、生物碱、挥发性物质和有机酸等多种免疫活性成分，不仅对疾病和病原微生物有抑制作用，还能调节畜禽体内细胞因子的生成和释放、增强免疫和繁殖能力，具有良好的替抗潜力[18-20].Chu等[21]研究发现黄芪多糖、淫羊藿多糖、当归多糖、蜂胶黄酮和黄芪总苷均可在体内和体外不同程度地提高T淋巴细胞中IL-2 mRNA的表达水平.在饲料中添加黄芪、当归、柴胡、鱼腥草等组成的中草药制剂可提高雏鸡脾脏中IL-2、IL-4和IFN-γ的mRNA表达量[22].而本研究使用复方中草药制剂处理湖羊母羊后，发现该制剂可以在转录水平上提高湖羊外周血中IL-2、IL-8、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表达量(P<0.05)，降低IL-6和TNF-α的mRNA表达量(P<0.05)，该结果可以为该制剂在临床上的应用提供试验基础.但是细胞因子基因的转录和表达受到多种因素的综合调控，并且细胞因子之间作用效果、作用途径也不尽相同[23].因此，该制剂的免疫机理研究还应联合其他免疫效应，综合分析，本次试验结果为下一步工作提供了重要参考和启示.