转录因子KLF7高表达与前列腺癌发生的相关性及其靶基因预测

李雪，唐慧,2，桑海明，李伟，王竞州，庞槐，张君*

(1 石河子大学医学院/新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832000;2 石河子大学科研处，新疆 石河子 832000;3 新疆石河子市人民医院泌尿外科，新疆 石河子 832000;4 石河子大学医学院第一附属医院检验科，新疆 石河子 832000)

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是欧美国家老年男性死亡的重要原因之一。在世界范围内，男性恶性肿瘤中PCa的发病率排名第2位，死亡率排名第5位[1]。在西方发达国家PCa是最常见的男性肿瘤，约占男性恶性肿瘤的1/3，病死率占第3位[2]。20世纪末至21世纪初的10年期间，中国PCa发病率的上升速度是同期瑞典、荷兰等传统高发地区6倍左右[3-4]。尽管已有大量的研究关注PCa发生发展的分子机制，但目前仍然不是十分明确。因此，寻找PCa发生发展过程中的关键因子，将为临床预防和治疗PCa提供理论基础和分子靶标。

Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一类具有锌脂结构的转录因子，目前发现并命名的KLF家族成员有18个，广泛参与细胞增殖、分化以及胚胎发育等多个生命活动的调控[5-7]。已有研究表明，KLFs家族的多个成员参与多种肿瘤的发生过程[8]。有关KLF7(Krüppel-like factor 7)与肿瘤发生发展的关系，目前研究较少，DING X J等[9]的研究发现，KLF7过表达可通过下调E-钙粘蛋白的表达，促进口腔鳞状细胞癌的迁移和表皮间充质转化。JIANG Z等[10]报道KLF7可作为侵袭性胃癌和预后不良的分子标志物。最近的研究则表明，miR-185可以通过靶向下调KLF7的表达，从而抑制非小细胞肺癌的增殖和侵袭能力[11]。本课题组前期研究发现，KLF7可通过与炎症因子IL-6启动子区靶向结合促进其表达[12]。

有关KLF7与PCa发生发展的关系目前尚未见文献报道。因此本研究在收集前列腺增生和PCa患者前列腺组织的基础上，运用免疫组织化学法比较KLF7及其下游因子IL-6，以及肿瘤发生相关因子E-钙粘蛋白、Ki67在前列腺癌患者癌组织中的表达差异，同时运用生物信息学方法对KLF7可能的下游靶基因进行预测，为阐明PCa发生的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源与纳入标准

于新疆石河子市人民医院泌尿外科调取2017-2019年住院病人病历资料，选取血清游离前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)>3.5 ng·mL-1，结合病理穿刺结果明确诊断为前列腺癌(PCa)患者30例，以及前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH)患者22例，收集患者一般资料及血糖、血脂等生化指标，根据病人病案号于病理科调取病人石蜡包埋组织标本。本研究方案通过了石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会的审查，并批准实施(2017-049-01)。

1.2 样本分组

根据纳入标准，将样本分为前列腺增生组(BPH，n=22)以及前列腺癌组(PCa，n=30)，比较两组受试个体的一般资料和血糖、血脂含量。选取BPH和PCa患者石蜡包埋前列腺组织，免疫组织化学法检测前列腺组织中KLF7、IL-6及E-钙粘蛋白的表达水平。

1.3 血脂血糖水平检测

血清PSA采用化学发光法检测，血糖 (Glucose,Glu)、总胆固醇 (Total cholesterol,TC)、甘油三酯 (Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白 (High density lipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白 (Low density lipoprotein,LDL-C) 均采用全自动生化分析仪检测。

1.4 HE及免疫组织化学法

1.4.1 HE染色

(1) 将石蜡切片置于烘箱中60 ℃烤30 min；(2) 石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水；(3) 苏木素染5 min；流水冲洗，去余色；(4) 0.7%盐酸乙醇分化3～5 s；(5)流水冲洗，切片变蓝约3～5 min；(6)酒精性伊红染30 s；(7)I 95%乙醇30 s，II 95%乙醇30 s，I 100%乙醇30 s，II 100%乙醇30 s，I二甲苯30 s，II二甲苯30 s；(8)中性树胶封片。

1.4.2 免疫组织化学染色

KLF7购于abcam公司(货号：ab197690)；IL-6购于中杉金桥(货号：TA50067)；E-钙粘蛋白抗体购于中杉金桥(货号：ZM0092)；Ki67购于中杉金桥(货号：ZM-0166)。免疫组织化学步骤如下：(1)将石蜡切片置于烘箱中60 ℃烤30 min；(2)二甲苯脱蜡 3×5 min，酒精脱二甲苯 3×5 min；(3)用枸橼酸钠修复液，提前用微波炉加热，高压锅沸腾后调至800 W,8 min关火；(4)将修复盒放入水盆置室温，3% 双氧水处理切片 避光10 min以灭活性内源性过氧化物酶活性；(5)PBS洗3×5 min，滴加适当比例稀释的一抗，4 ℃过夜。(6)37 ℃复温30 min，PBS洗去一抗 3×5 min；(7)滴加生物素标记的二抗(PV6000)，室温或37摄氏度孵育30～60 min；(8)PBS洗去二抗 3×5 min；配置DAB显色液，每张切片50～100 μL；(9)显色显色结束后立即用自来水冲去显色液；(10)苏木素染核3～5 min，酸酒精5 s，用水冲洗；(11)酒精脱水，二甲苯透明，选择适当的封片剂(中性树胶)封片。

1.4.3 免疫组织化学染色评分

染色强度对应值：阴性0分，浅棕色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。然后将阳性细胞百分比×染色强度对应的值作为评分。

1.5 生物信息学预测KLF7下游靶基因(图1)

在转录因子靶基因预测数据库Cistrome Data Browser中输入“KLF7”，得到3个项目ENCSR604VWJ_1、ENCSR604VWJ_2和GSM2026749，以score≥0.5为筛选标准，从3个项目中共筛选出144个KLF7预测靶基因。然后在生物信息学软件DAVID中对144个靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，分析流程见图1。

图1 生物信息学分析KLF7下游关键基因流程图

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 受试个体一般资料比较

比较前列腺增生个体和PCa患者一般资料和血糖、血脂水平后发现，PCa患者血清PSA水平显著高于前列腺增生个体，差异具有统计学意义(P<0.05)，而其它一般资料在3组间均无显著差异。(表1)。

表1 受试个体一般资料比较

2.2 BPH与PCa患者前列腺组织中KLF7及其下游因子IL-6蛋白表达水平的比较

比较BPH患者(n=22)前列腺组织和PCa患者(n=30)肿瘤组织中的KLF7及IL-6表达情况，结果显示：PCa患者癌组织中KLF7及IL-6的表达水平均显著高于增生的前列腺组织(P<0.05)(图2，3)。以上结果提示：作为转录因子的KLF7高表达，可能通过转录激活IL-6诱发炎症反应最终导致前列腺癌的发生发展，而炎症反应在PCa发生过程中的作用尚需进一步实验加以证实。

图2 免疫组化染色比较PCa与BPH组织中KLF7的表达情况

图3 免疫组化染色比较PCa与BPH组织中IL-6的表达情况

2.3 前列腺增生与前列腺癌患者组织中肿瘤发生相关因子E钙粘蛋白、Ki67蛋白表达水平的比较

比较BPH患者(n=22)前列腺组织和PCa患者(n=30)肿瘤组织中肿瘤发生相关因子E钙粘蛋白、Ki67的表达情况，结果显示：PCa患者癌组织中Ki67的表达水平显著高于增生的前列腺组织(P<0.001)(图4)；而E-钙粘蛋白的表达在两组间无显著差异(图5)。

以上结果证实：细胞周期紊乱是PCa发生过程中的重要条件，而这一过程是否与KLF7高表达有关，值得进一步探讨和研究。

图4 免疫组化染色比较PCa与BPH组织中Ki67的表达情况

图5 免疫组化染色比较PCa与BPH组织中E-钙黏蛋白的表达情况

2.4 前列腺癌患者癌组织中KLF7表达与各因子间的相关性分析

将PCa患者癌组织中KLF7表达与其他各因子进行相关性分析后发现，KLF7的表达与患者血清中PSA含量显著正相关(r=0.465,P=0.001)，与癌组织中IL-6的表达显著正相关(r=0.437,P=0.014)，与癌组织中Ki67的表达显著正相关(r=0.434,P=0.002)，与癌组织中E-钙粘蛋白的表达显著正相关(r=0.473,P=0.009)；并且癌组织中IL-6、Ki67的表达均与患者血清中前列腺癌特异性抗原的含量显著正相关(r=0.427，P=0.026；r=0.553，P<0.001)(图6)。

图6 前列腺癌患者癌组织中KLF7表达与各因子的相关性分析

2.5 KLF7下游靶基因预测

在Cistrome Data Browser数据库中预测KLF7下游靶基因，按照图1流程图进行分析：将三个项目预测结果取交集后共得到144个靶基因。随后将144个靶基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集结果将以上基因分为3类：生物过程(Biology Process,BP)、细胞组分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)(表2)。以上基因主要有53个GO条目富集于生物过程，主要包括调控转录、调控RNA代谢过程、细胞周期进程、负向调控大分子代谢过程、负向调控基因表达等；有26个GO条目富集于细胞组分，主要包括非膜结合细胞器、细胞器内腔、膜封闭腔、细胞骨架、细胞浆、核浆等；有12个GO条目富集于分子功能，主要包括DNA结合、金属离子过渡结合、锌离子结合、转录调节活动、RNA结合等(图7)。以上结果提示，通过生物信息学预测的KLF7下游靶基因能够富集到癌症相关进程，包括调控转录、细胞周期进程、核酸结合、锌离子结合等，以上基因中与癌症相关的基因有：STAT3,DDX20,ZNF233,ZNF581,ZNF487,ZNF580,ZNF391,ZNF793,HMGB1,DMAP1,CTNNB1,ZBTB45等。

表2 144个靶基因功能分类

表2续

表2续

表2续

图7 靶基因富集于分子功能的12个GO条目

3 讨论

Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一类具有锌指结构的转录因子，目前发现并命名的KLF家族成员有18个，广泛参与细胞增殖、分化以及胚胎发育等多个生命活动的调控[5-7]。已有研究表明，KLFs家族的多个成员参与多种肿瘤的发生过程，并且发挥着截然不同的作用，如：KLF4的低表达与乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌等多种肿瘤的发生负相关；KLF5的高表达促进了乳腺癌、食管癌等肿瘤的发生；KLF6的高表达与乳腺癌、前列腺癌等的发生显著正相关[8]。

KLF7定位于细胞核中，作为一个转录因子可对靶基因发挥转录激活作用[13]。KLF7与肿瘤发生发展的关系目前研究较少，在仅有的几篇报道中，均表现出促癌的作用，但具体的作用机制尚不十分明确[9-11]。有关KLF7表达在PCa发生过程中的作用，目前尚未见文献报道。本研究运用免疫组织化学法比较后发现，PCa患者癌组织中KLF7的表达水平显著高于前列腺增生患者前列腺组织，提示KLF7高表达可能与PCa的发生有关，其作用的具体分子机制值得进一步深入研究。目前已有的机制研究，均阐明的是KLF7的表达如何受到影响，即研究的是KLF7的上游，而高表达的KLF7是如何导致肿瘤发生的研究甚少[14-16]。

有关炎症因子IL-6与肿瘤发生发展的关系，近年来也有文献报道，在癌前病变的细胞中，炎性细胞因子IL-6等能够促进NF-κB和STAT3的表达，调控细胞生长、增殖、分化、血管生成等过程，促进肿瘤的发生发展[17]。FRIEDENREICH C M等[18-19]研究表明，子宫内膜癌个体血浆IL-6及TNF-α的水平显著高于对照个体，并且IL-6可以促进体外子宫内膜癌细胞的增殖。已有文献提出[20]，前列腺周围组织中脂肪细胞、巨噬细胞及T细胞来源的IL-6可能通过旁分泌的方式促进前列腺癌的发生与发展。HAYASHI T等[21]的研究发现，高脂饮食下前列腺巨噬细胞可通过分泌IL-6促进前列腺癌细胞生长。

本研究结果显示：IL-6在前列腺癌患者癌组织中的表达显著升高。以上提示：IL-6的高表达在前列腺癌的发生发展过程中发挥重要作用，但其高表达的具体原因目前尚不十分明确。ZHANG M X等[12]研究发现，KLF7可通过与IL-6启动子区靶向结合促进其表达。结合本研究中KLF7与IL-6均在前列腺癌组织中高表达，并且癌组织中KLF7的表达与患者血清PSA含量及IL-6表达均显著正相关，IL-6表达也与患者血清PSA含量显著正相关，以上结果提示KLF7可能通过调控IL-6的表达促PCa的发生，其具体的机制有待进一步研究。

Ki67和E-钙粘蛋白均已被证实与多种肿瘤的发生发展密切相关，并作为诊断标志物广泛应用于临床[22]，而有关KLF7与Ki67和E-钙粘蛋白在前列腺癌中表达的相关性，目前尚未见报道。本研究结果显示：前列腺癌组织中KLF7的表达与Ki67及E-钙粘蛋白的表达均显著正相关，提示上述因子之间可能存在内在联系并且与前列腺癌的发生有关，而做为转录因子的KLF7是否通过转录激活作用上调Ki67及E-钙粘蛋白的表达，有待进一步的深入研究加以证实。此外，生物信息学初步分析结果显示，做为转录因子，KLF7可能通过调控一系列肿瘤相关基因的表达参与肿瘤发生发展的过程，而上述基因中具体何种基因参与了KLF7高表达导致前列腺癌发生的过程，尚需进一步的体内外实验加以证实。