miR-20a-5p表达对胃粘膜相关组织淋巴瘤增殖的影响及其机制研究

农卫霞,王奎

(1 石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832000；2 石河子大学医学院，新疆 石河子 832000)

粘膜相关淋巴组织(mucosal associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤发病率约占全部淋巴瘤的10%[1]。胃MALT淋巴瘤是其中主要的类型之一，发病机制与幽门螺杆菌的慢性感染密切相关[2-3]，因此长期使用清除幽门螺杆菌的抗生素治疗是MALT淋巴瘤的主要方式[4]。但长期使用抗生素容易引起过敏、肝肾损伤及神经系统损害等多种副反应[5]，超过半数患者还可复发[6]。因此，探索和寻找胃MALT淋巴瘤新靶点有助于提高疗效并降低复发率。

小分子RNA(MicroRNAs,miRNAs)是一类非编码的内源性小分子RNA，研究发现大量异常表达的miRNAs可通过表观遗传学修饰来调控转录水平而影响肿瘤的进程[7-8]。通过筛选肿瘤组织中异常表达的miRNAs，为肿瘤早期诊断、预后监测和基因的靶向治疗提供思路[9]。ZHANG Y等[10]认为miR-320a和miR-429与某些靶基因的表达趋势与微阵列分析结果一致，提示miR-320a和miR-429可能是参与胃MALT淋巴瘤发病机制的新型miRNA。SONG Y等[11]检测122例原发性胃MALT淋巴瘤的边缘区B细胞淋巴瘤患者miR-383在肿瘤组织和细胞系中的表达呈低表达，体外研究显示miR-383靶向ZEB2来抑制MALT淋巴瘤细胞的增殖。类似的研究也显示miR-21是弥漫大B细胞淋巴瘤关键的原癌基因[12]。

作为致癌基因，miR-20a-5p通过负调控肿瘤抑制基因促进肿瘤形成，如GUO L等[13]研究乳腺癌细胞源性外泌体miR-20a-5p通过靶向SRCIN1促进破骨细胞的增殖和分化，HUANG D等[14]认为MiR-20a-5p通过在鼻咽癌细胞中靶向Rab27B来抵抗化疗。但miR-20a-5p在胃MALT淋巴瘤发生发展中的作用目前报道尚少。本研究拟采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测人胃MALT淋巴瘤组织及癌旁组织miR-20a-5p表达，考察miR-20a-5p对Raji淋巴瘤细胞增殖的影响，为靶向治疗胃MALT淋巴瘤提供依据。

1 资料与方法

1.1 病例资料与纳入标准

收集2015年1月～2019年1月石河子大学医学院第一附属院普外科手术切除的组织冻存标本，胃MALT淋巴瘤及其相邻的正常粘膜组织18例，其中男性10例和女性8例；年龄32～63岁，平均年龄(48.2±10.8)岁；5名患者经胃镜活检确诊，13名患者经手术病理组织学检查证实；病变部位胃底4例、胃体3例、胃窦9例、幽门2例；参照Lisaacson等的分型标准进行MALT淋巴瘤组织学分类：所有淋巴瘤组织经病理学鉴定均为低度恶性肿瘤，邻近的癌旁组织呈现阴性，即无肿瘤细胞浸润。所有患者在正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography/computed tomography,PET/CT)检查前均直接未行放疗、化疗和手术治疗，既往无淋巴瘤病史。本研究根据医院伦理委员会批准的方案进行，不违背《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》相关原则。所有患者均了解手术的风险及受益，同意将术中切除的癌变组织及为确保癌组织被切除完全需切除相邻的部分正常粘膜组织用于科学研究，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

miR-20a-5p mimic、miR-20a-5p inhibitor及阴性对照均由上海吉玛公司合成；Lipo2000购自美国Invitrogen公司；RPMIl640培养基购自美国Hyclone公司；Opti-MEM培养基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自同仁化学公司；结晶紫购自美国Sigma公司；TRIZOL试剂和细胞裂解液均购自美国Thermo scientific公司；GAPDH抗体和人Runt相关转录因子3(unt related transcription factor 3 gene,RUNX3)单克隆抗体均购自美国Abcam公司。-80 ℃超低温冰箱购自日本SANYO公司；CO2恒温培养箱购自美国Thermo Scientific公司；ABI 7300 型PCR仪购自美国ABI公司；微量移液枪购自美国Eppendorf公司；生物安全柜购自香港Heal Force公司；酶标仪及低温高速离心机均购自美国Thermo Scientific公司；超纯水仪购自美国Millipore公司；细胞培养瓶、细胞冻存管及Transwell小室均购自美国Coming公司。

1.3 细胞培养

人B细胞淋巴瘤Raji细胞株由中国科学院上海细胞库提供，采用含10%FBS的RPMI1640完全培养基于37 ℃含5%CO2培养箱中培养，选用对数生长期的细胞进行实验。

1.4 细胞转染实验

将处于对数期的Raji细胞按照每孔1 × 105个接种于6孔板，当细胞融合70%～80%，进行转染。按是否转染，将细胞分为4组：miR-20a-5p mimic negative control转染组(miR-20a-5p mimic NC)、miR-20a-5p mimic转染组(miR-20a-5p mimic)、miR-20a-5p inhibitor negative control转染组(miR-20a-5p inhibitor NC)和miR-20a-5p inhibitor转染组(miR-20a-5p inhibitor)，每组设3个复孔。参照Lipofectamine2000操作说明书，将miR-20a-5p mimic NC、miR-20a-5p mimic、miR-20a-5p inhibitor NC和miR-20a-5p inhibitor与脂质体按比例混合，室温静置20 min。将之前铺好的培养板中培液弃去，PBS清洗。每孔中加入opti-MEM补至1 mL，转染24 h，收集细胞，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞的miR-20a-5p表达。

1.5 细胞增殖活性检测(cell counting kit-8,CCK-8)细胞增殖能力

每孔2 × 104个细胞接种于96孔板，每组设6个复孔：空白对照组、miR-20a-5p mimic NC、miR-20a-5p mimic、miR-20a-5p inhibitor NC和miR-20a-5p inhibitor组，按1.4项步骤转染。选取24、48、72 h 3个时间点，每孔加100 μL培养基和10 μL CCK-8溶液并培养2 h，采用酶标仪测定各组细胞450 nm波长的吸光度。

1.6 细胞迁移实验

转染miR-20a-5p mimic或miR-20a-5p inhibitor后48 h收集细胞，进行细胞迁移实验。在无血清的DMEM中，Raji细胞接种到Transwell小室的上室，将10%胎牛血清的DMEM添加到下室。37 ℃培养24 h，移除小室中残留的细胞，福尔马林固定30 min，0.1%结晶紫染色5 min，镜下观察，使用image pro plus软件计数。迁移抑制率/%=(1-实验组迁移细胞数/正常对照组迁移细胞数)×100%

1.7 qRT-PCR检测组织或细胞mRNA相对表达量

将胃MALT淋巴瘤切除的样本研磨后移入无酶EP管中，加Trizol试剂。将4个组的细胞样本(miR-20a-5p mimic组、miR-20a-5p inhibitor组及对应的NC组)，加Trizol试剂。将加入Trizol的组织或细胞样品室温放置5 min，每管加入200 μL氯仿，振荡混匀15 s，室温静置5 min，离心取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，-20 ℃静置30 min。4 ℃12 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇，混匀重悬，4 ℃12 000 r·min-1离心5 min，弃上清，DEPC水溶解。采用分光光度计检测各组总RNA的浓度及纯度。

利用反转录试剂盒进行逆转录，按照qRT-PCR反应体系配制20 μL的反应体系，放入7500 型PCR仪内扩增。按2-ΔΔCt法计算miR-20a-5p及RUNX3的相对表达，U6和GAPDH分别为miR-20a-5p及RUNX3的内参。

表1 引物序列

1.8 Western blotting试验

取各组的Raji细胞样本，加入蛋白裂解液裂解，使用蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度法，通过SDS-PAGE将细胞总蛋白分离，湿法转至PVDF膜上，室温封闭后孵育RUNX3抗体4 ℃过夜(ab49117，工作浓度1.25 μg·mL-1)。去除一抗孵育液，1×PBST漂洗，加入1×PBST液稀释的山羊抗兔IgG H&L (HRP)(ab205718，工作浓度1∶2000)室温孵育1 h，加入发光液成像，imageJ软件分析。

1.9 Luciferase活性测定

含有RUNX3 3'-UTR野生型(Wt)和3'-UTR突变体(Mut)的荧光素酶报告质粒由GenePharma公司构建。转染前24 h，将细胞接种于24孔板，使用Lipofectamine 2000混合miR-20a-5p mimic和荧光素酶报告基因重组质粒共转染淋巴瘤细胞。培养48 h，将收集的细胞液氮反复冻融2次，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，收集上清，将细胞提取液以及Luciferase反应底物22 ℃水浴10 min，加入100 μL Luciferase反应底物及20 μL细胞提取液，读数。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 miR-20a-5p在胃MALT淋巴瘤的表达

miR-20a-5p在人胃MALT淋巴瘤表达增高，显著高于邻近正常粘膜组织，差异有统计学意义(P<0.000 1)(图1)。

与邻近正常粘膜组织相比，**P<0.05图1 qRT-PCR检测胃MALT淋巴瘤与邻近正常粘膜组织的miR-20a-5p的表达(n=18)

2.2 miR-20a-5p对淋巴瘤细胞的增殖和迁移的影响

与正常Raji细胞相比，miR-20a-5p mimic转染显著提高miR-20a-5p的表达，差异存在统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，miR-20a-5p inhibitor转染显著提抑制miR-20a-5p的表达，差异存在统计学意义(P<0.05)(图2)。

miR-20a-5p mimic转染与正常Raji细胞或miR-20a-5p mimic对照组相比，**P<0.05；miR-20a-5p inhibitor转染组与miR-20a-5p inhibitor转染对照组相比，##P<0.05图2 qRT-PCR检测Raji细胞转染后miR-20a-5p的相对表达量

CCK-8实验数据显示，与正常对照组相比，miR-20a-5p mimic组细胞的OD450值在48 h和72 h均明显增加，miR-20a-5p inhibitor组细胞的OD450在48 h和72 h均明显降低，差异存在统计学意义(P<0.05)(图3)。

miR-20a-5p抑制剂可明显抑制Raji细胞的迁移作用，差异存在统计学意义(P<0.05)(图4、表2)。

图3 CCK-8检测miR-20a-5p对Raji细胞增殖的影响

图4 细胞迁移实验检测miR-20a-5p对Raji细胞迁移的影响(×100)

表2 Raji细胞迁移抑制率

2.3 miR-20a-5p直接靶向RUNX3表达

miRbase数据库包括了大量已报道的miRNA的前提序列及成熟序列，本研究查找该数据库找到了人源miR-20a-5p的成熟序列，通过TargetScan (http://www.targetscan.org)、Microrna (http://www.microrna.au.uk/cgibin/targets/v4/search.pl) 及DIANA LAB (http://www.diana.cslab.ece.ntua.gr)3种生物信息学软件算法预测分析显示RUNX3蛋白为miR-20a-5p的主要的候选靶点之一。RUNX3蛋白是一个有前景的肿瘤促癌基因，参与多种癌症的发生发展。例如，miRNA-20a-5p可通过靶向RUNX3促进三阴性乳腺癌细胞的生长[15]，miR-20a-5p可调控RUNX3的表达。

Western blot结果显示外源miR-20a-5p可下调RUNX3的蛋白水平，转染miR-20a-5p inhibitor可恢复RUNX3蛋白水平。双荧光素报告实验进一步评估，与RUNX3-Wt相比，miR-20a-5p能够抑制RUNX3的Mut 3′-UTR报告载体的荧光素酶活性(P<0.05)(图5)。

图5 miR-20a-5p直接靶向RUNX3的表达

2.4 RUNX3蛋白在人胃MALT淋巴瘤组织中的表达(图6)

与邻近的正常粘膜组织相比，胃MALT淋巴瘤组织中RUNX3蛋白表达显著降低(P<0.000 1)。miR-20a-5p和RUNX3 mRNA表达呈负相关趋势(r=-0.502,P<0.05)(图6)。

图6 miR-20-5p下调胃MALT淋巴瘤中RUNX3的表达

3 讨论

胃MALT淋巴瘤是一种低度恶性B细胞非霍奇金淋巴瘤，其病理机制与胃癌相似，可发生于胃的任何部位，最常见于胃窦，如本文纳入的18例胃MALT淋巴瘤中9例病变部位为胃窦。miRNA参与调控多种实体瘤的发生、侵袭转移等过程，作为疗效评判和预后指标，具有重要的临床价值，miRNA在胃MALT淋巴瘤的发病过程中扮演怎样的角色，对胃MALT淋巴瘤的治疗又有怎样的启示等是近年来研究的热点问题。

miR-20a-5p是肿瘤中频繁发生改变的miRNA之一，在很多恶性肿瘤中表达异常并参与肿瘤的发病过程[16]：miR-20a-5p在胃癌细胞系及癌组织中呈高表达，并与淋巴结侵袭转移及浸润深度有关；miR-20a-5p可负向调控TNFRSF21促进头颈鳞癌细胞增殖，与miR-20a-5p通过调控趋化因子受体-7(chemokine C-C-motif receptor 7,CCR7)来促进细胞的迁移和侵袭能力紧密相关；在同一淋巴瘤的不同亚型中，miR-20a-5p在肿瘤组织的表达也存在明显的不同，如WU Y Y等[17]研究显示，生发中心 B 细胞样(germinal center B cell,GCB)是弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中一类常见的亚型，miR-20a-5p的表达显著高于非GCB型的DLBCL，提示miR-20a-5p可能与DLBCL生发中心形成有关；CHEN Y等[18]对比了miR-20a-5p在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织和邻近正常组织的表达，结果表明miR-20a-5p在HCC中高表达。

尽管miRNA参与调控多种实体瘤的发生发展过程，但miR-20a-5p在胃MALT淋巴瘤中的表达模式和作用机制报道较少。本研究结果表明，miR-20a-5p在胃MALT淋巴瘤组织中的表达显著高于邻近的正常粘膜组织，66.7%(12/18)的肿瘤样本miR-20a-5p表达显著增加。进一步的转染研究显示，用人工合成的外源性miR-20a-5p mimic提高或抑制剂抑制miR-20a-5p的表达，结果显示外源性miR-20a-5p mimic可促进细胞增殖，而抑制miR-20a-5p表达可降低肿瘤细胞的增殖能力，进一步证实miR-20a-5p与MALT淋巴瘤的发病紧密相关，因而有必要探讨miR-20a-5p促进胃MALT淋巴瘤发生发展的可能机制。

大量研究表明RUNX3是一类的重要的转录因子，参与多种疾病的发生发展，调控肿瘤的病变活动，作为一种肿瘤抑制因子，在多种肿瘤中发挥抑制作用[19]。当RUNX3在实体肿瘤中功能降低或失活，肿瘤容易增殖或发生转移，影响预后。临床研究表明RUNX3表达缺失可能与胃癌患者的淋巴结转移和生存期缩短密切相关[20]，使用生物信息学软件TargetScan分析发现，RUNX3的3'UTR区含有一个潜在的miR-20a-5p结合位点，能够靶向结合RUNX3的3'UTR区，抑制RUNX3 mRNA的翻译，在肝癌的分子机制研究中，下调RUNX3蛋白表达可促进肝癌细胞的增殖和侵袭。在本研究的miRbase数据库查找人源miR-20a-5p的成熟序列，通过TargetScan、Microrna 及DIANA LAB 三种生物信息学软件算法预测到肿瘤抑制因子RUNX3为miR-20a-5p的候选靶点，体外转染及荧光素酶报告基因实验也证实RUNX3是miR-20a-5p的直接靶点。类似的研究在乳腺癌及肝细胞癌也有报道，如BAI X D等[21]研究显示，乳腺癌的miR-20a-5p呈高表达，当miR-20a-5p呈低表达时，乳腺癌裸鼠的肿瘤生长明显减缓，高表达的miR-20a-5p显着降低RUNX3的mRNA和蛋白水平，RUNX3是为人类乳腺癌miR-20a-5p的靶标，表明miR-20a-5p在乳腺癌具有潜在临床应用前景。CHEN Y K[22]等人研究显示miR-20a-5p在肝细胞癌组织中呈现异常表达，超过1/2的肿瘤组织中呈高表达，体外研究显示miR-20a-5p过表达可促进肝细胞癌细胞的增殖和迁移，抑制miR-20a-5p表达可抑制肝细胞癌的增殖活性及迁移程度，进一步，与非肿瘤组织相比，肝细胞癌组织中RUNX3的mRNA和蛋白表达明显降低，miR-20a-5p的过表达可通过抑制RUNX3的翻译促进了肝细胞癌细胞的增殖和迁移。

综上所述，miR-20a-5p在胃MATL淋巴瘤中呈高表达并具有致癌特性，体外研究显示miR-20a-5p可促进Raji细胞增殖，可能与下调RUNX3蛋白表达有关。本研究对miR-20a-5p调控胃MATL淋巴瘤的发病机制进行了初步探讨，为miRNAs应用于淋巴瘤的治疗及预后评估提供了新的思路，但miR-20a-5p在体内的作用有待深入研究。