不同稻秸平菇菌糠营养成分差异及其体外瘤胃发酵特性研究

姜奥宇，胡 莲，陈 东*，唐启源，郭 楠，沈维军，万发春，任 杰，李付强

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；2.娄底市新化县农业农村局，湖南娄底 417600；3.湖南农业大学农学院，湖南长沙 410128；4.浏阳市动物疫病防控中心，湖南浏阳 410300；5.湖南天华实业有限公司，湖南娄底 417000）

水稻作为我国重要农作物之一，年播种面积约为3 000 万hm2，稻谷年产量为2 亿t 以上[1]，按谷草比1:1[2]计算，每年产生水稻秸秆约为2 亿t，通过测算，我国主要农作物秸秆总量呈稳步缓慢上升趋势，其年平均增长率为1.66%。农作物秸秆氮、磷、钾等矿物元素含量丰富，但纤维含量较高，养分利用率较低[3]，通过食用菌栽培方法可以提高秸秆利用附加值，发酵后菌糠可饲喂动物，对发展绿色农业、提升农业经济效益具有重要意义。平菇在我国人工栽培食用菌中产量第一，具有重要的食药用价值[4]。将食用菌栽培副产物菌糠适当替代日粮粗饲料，有利于提高干物质采食量及营养物质瘤胃降解率[5-6]。目前，利用真菌发酵改善秸秆及菌糠养分利用率的研究颇受关注。龚剑明等[7]将P.chrysosporium等4 种真菌接种油菜秸秆进行固态发酵，发现其常规养分及几丁质含量显著提高，且体外发酵有机物降解率不同程度提高。利用白腐真菌处理农作物秸秆可改变其木质素等异质高聚大分子物质结构，显著提高秸秆瘤胃干物质消失率[8]。刘启燕等[9]研究发现，金针菇菌糠的纤维含量优于稻草、燕麦草及青贮，用其饲喂奶牛可显著提升产奶量，在一定程度上发酵菌糠有利于改善奶牛的健康状况。作为草食动物粗饲料资源，菌糠广受关注，目前研究主要集中在单一的真菌发酵或直接利用副产物进行饲喂，对不同收菇茬次菌糠的系统研究鲜见报道。本试验以稻草秸秆（以下简称“稻秸”）为主要碳源，辅以麸皮和豆粕混合接种平菇菌株，评价不同收菇次数稻秸平菇菌糠常规养分含量及体外发酵特性，为平菇发酵稻秸技术以及高效利用菌糠资源提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 平菇栽培料接种与制作 平菇菌种由湖南农业大学食用菌工程研究中心提供，稻秸为大通湖区宏硕生态农业农机合作社试验地种植的水稻（湘两优900）完熟收割后的剩余秸秆。真菌接种过程参考文献[10]：将稻秸切至1.5～2.5 cm 长短，在1%（质量体积比）石灰水中浸泡48 h 后沥干，按稻秸85%、麸皮10% 和豆粕5%（干物质基础）的比例混合均匀，装包（1 kg/ 包），栽培料营养成分如表1 所示；灭菌（120～125℃、0.15～0.20 MPa、4 h）后进行接种（1 cm×1 cm×1 cm 平菇块/包），菌种用量为栽培料质量的5%，在（25±2）℃下进行避光有氧培养。分别在第0、1、2 茬收集菌糠，65℃烘干粉碎后，选用60 目孔筛（250 μm 粒度）进行过筛，用于常规营养成分测定和体外发酵。

1.2 试验设计 选用3 种平菇真菌六月灰（Oyster Mushroom Liuyuehui，OML）、1676（Oyster Mushroom1676，OM1）和江都71（Oyster Mushroom Jiangdu71，OMJ）分别接种于表1 所示稻秸栽培料基质，接种当天记为第0 天，在菌丝长满出菇前收集菌糠，记为第0 茬菌糠，当平菇菌盖基本展开，其颜色呈现淡灰色或灰白色时进行收菇，第1 次收菇后收集菌糠，记为第1 茬，第2 次收菇后收集菌糠，记为第2 茬。共计3×3 个处理，每个处理3 个重复，同时设2 个空白对照样。各处理组信息见表2。

表2 各菌菇的收菇时间

1.3 体外模拟瘤胃发酵设备 本试验采用全自动体外模拟瘤胃发酵设备，具体参数设定及使用操作参照Wang等[12]研究。发酵瓶置于恒温培养箱中，通过导管与三通电磁阀（3V320-08，宁波奉化永利气动成套有限公司）和压力传感器（CYG130-12，昆山双桥传感器测控技术有限公司）连接。压力传感器对发酵瓶中的压力进行测定并记录，根据压力与气体体积间的关系计算72 h 气体生成量。当发酵瓶中压力到达设定排气压力（9 kPa）时，计算机控制电磁阀打开，发酵瓶中的气体通过导管进入气相色谱仪（安捷伦 7890A，美国）测定甲烷和氢气含量，其中甲烷检测用色谱柱规格（GB3591-80047）：2.44 m×3.175 mm×2 mm，火焰电离检测器（FID）检测温度为300 ℃，载体为N2（流速为30 mL/min）。氢气检测用色谱柱规格（GB3591-80047）：1.22 m×3.175 mm×2 mm，热导检测器（TCD）检测温度为200℃。根据甲烷和氢气含量、压力与气体体积间转化系数计算甲烷和氢气产量[13]。

1.4 人工瘤胃液培养液 瘤胃液供体羊选择3 只体况良好、体重（25.0±2.0）kg 且安装有永久性瘤胃瘘管的去势成年湘东黑山羊。饲粮参考《肉羊饲养标准》（NY/T 816-2004），配制精粗比为40:60 的基础饲粮。稻秸用铡草机切至2～3 cm 长短，精料经2.5 mm 筛粉碎，基础日粮配方及营养成分见表3。试验期内每头供体羊每天饲喂基础日粮500 g，每天于08:30 和18:00 饲喂。

表3 基础日粮组成和营养成分（风干基础）

人工瘤胃缓冲液：参照Menke 等[14]提供的方法配制2 400 mL 的人工瘤胃缓冲液。向缓冲液中持续通入CO2气体，加入2.0 mL 刃天青溶液后置于恒温磁力搅拌器上预热至39.5℃，保持溶液厌氧环境，直至缓冲液从蓝色转变为近无色即可。

人工瘤胃培养液：试验当天晨饲前1 h，通过瘤胃瘘管采集供体羊瘤胃液装入保温瓶，瘤胃液混合均匀后迅速用4 层脱脂纱布过滤于接收瓶，量取600 mL 过滤液迅速加入到准备好的2 400 mL 人工瘤胃缓冲液中（瘤胃液与缓冲液配比为1:4），期间持续冲入CO2确保厌氧环境，制成人工瘤胃培养液。

1.5 试验方法

1.5.1 体外模拟瘤胃发酵 称取0.6 g 底物放入150 mL发酵瓶中，加入60 mL 人工瘤胃培养液，放置于恒温培养箱（振荡频率50 r/min，温度39.5℃）中预热。取出发酵瓶，通入CO2保证厌氧环境。依次向每个发酵瓶中加入60 mL 人工瘤胃培养液，并将发酵瓶放回恒温培养箱中进行体外模拟瘤胃发酵，72 h 后终止发酵。

1.5.2 样品采集 体外模拟瘤胃发酵，72 h 后终止发酵，取2 mL 发酵液，4℃、15 000 r/min 离心10 min。取1 mL上清液于2 mL 离心管中，加入0.1 mL 25% 偏磷酸固定15 min，-20℃保存，用于总挥发性脂肪酸（TVFA）、氨态氮（NH3-N）测定。将发酵内容物用纱布抽干置于铝盒中，105℃烘箱中烘8 h，测定干物质降解率（DM Degradability，DMD）。

1.5.3 指标测定 干物质（DM）、CP、NDF、ADF、EE分别按标准（GB/T 6435-2014、GB/T 24318-2009、GB/T 20806-2006、NY/T 1459-2007、GB/T 6433-2006）进行测定，总能（GE）采用氧弹燃烧法测定，用Spectrum 公司SI400 型pH 计测定体外发酵液pH。通过装有检测器和HP-INNOwax（30.0 m×320 μm×0.5 μm，Catalog No:19091N-213）毛细管色谱柱的气相色谱仪（GC-2010；Shimadzu Corporation，Japan）测定VFA。体外发酵滤液采用T/CAAA 003-2018 中的苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N 含量。

DMD=（放入发酵瓶前底物重-终止发酵后残留底物重）/（放入发酵瓶前底物重）×100%

1.6 统计分析 数据经Excel 2010 整理，使用SPSS 24.0 统计软件中一般线性模型（GLM）的多因素方差分析计算两因素（品种、茬次）的主效应及交互效应，差异显著则运用Duncan's 法进行多重比较，结果表示为平均值和标准误，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 3 种平菇不同收菇茬次对菌糠营养成分的影响 由表4 可知，OML 组的CP 和TDN 含量显著高于OM1和OMJ 组，且NDF 和ADF 含量显著低于其他两组，OMJ 组EE 和GE 含量较高；CP、NDF、ADF 以及TDN 在不同品种、茬次及两者交互上均具有极显著效应，且3 组稻秸平菇菌糠NDF 和ADF 含量随着收菇茬次增加而逐渐降低，说明纤维成分得到有效降解。总体来看，OML 菌糠的营养成分更优。

2.2 3 种平菇不同收菇茬次对菌糠体外发酵的影响 由表5 可知，体外瘤胃发酵试验中，3 组稻秸平菇菌糠发酵产物各有差异。72 h 总产气量、甲烷及氢气产量均表现为OML-0 组显著高于其他组，且茬次和交互效应为极显著。在DMD 方面，OM1 和OMJ 组DMD 先减后增，OML 组呈逐渐降低的趋势，且OML-0 组显著高于其他组。随着收菇茬次的增加，OM1 和OMJ 组体外发酵NH3-N 和TVFA 浓度表现为先增后减的趋势，而OML-0 组NH3-N 和TVFA 浓度分别达到9.80 mg/dL 和74.67 mmol/L，为所有试验组产量最高值。

2.3 不同稻秸平菇菌糠体外发酵VFA 各组分分析 由表6 可知，OMJ 组乙酸和丙酸比例较OM1 和OML 组更为稳定，OM1 组丙酸比例显著高于其他两组，OML组丁酸、异丁酸、戊酸以及异戊酸比例均保持较高水平。OM1 和OML 组乙丙比随着收菇茬次增加均保持上升的趋势，OMJ 组差异不显著，且乙酸、丙酸、丁酸和乙丙比的品种、茬次以及交互效应均达显著水平。

3 讨 论

3.1 不同稻秸平菇菌糠营养成分 菌糠营养成分与食用菌的种类、收茬时期及培养基成分等多种因素有关。本试验中，3 种平菇菌糠随收茬时间延长，GE 均出现不同程度减少，这与平菇菌丝体在代谢过程中消耗基质能量进行纤维素降解有关[15]；除OML 品种外，OM1 和OMJ 均表现为第1 茬菌糠CP 含量最高，且相较于栽培料CP 含量提升72% 以上，原因可能是平菇菌糠中部分蛋白质来源于平菇真菌的转化和生物固氮作用，合成的菌体蛋白质部分残留菌糠中[16]，随着发酵时间延长，氮素转移至菌丝体[17-18]，这与张纯等[19]研究结果一致。龚剑明等[7]用不同真菌发酵油菜秸秆，发现养分含量及酶活性存在差异，本研究中OML-0 和OML-2组CP 含量均高于同时期其他2 种平菇菌糠，原因可能是OML 在菌糠中残留的菌体蛋白较其他2 种平菇更多，其次在平菇栽培过程中，不同时期蛋白酶的活性差异可能影响了菌糠CP 含量。在本试验中，3 种平菇菌糠随着收菇茬次的增加，NDF 和ADF 含量显著下降，在栽培料基础上降幅分别超过49%和45%，说明平菇真菌发酵可作为一种有效降低稻秸纤维素的手段，其主要机制为食用菌代谢过程中，菌丝体细胞分泌纤维素酶、木质素过氧化酶等胞外酶[20]，通过酶解作用把纤维素等大分子物质分解成单糖等可溶性碳水化合物[21]，降低NDF 和半纤维素含量。这也导致3 种平菇菌糠TDN 随收茬次数增加而显著增加，说明适当延长平菇真菌发酵时间有利于提升菌糠相对饲用价值。本研究发现，OML-2 组NDF 和ADF 降解率较栽培料降幅分别达到68%和71%，效果显著优于OM1 和OMJ，说明不同平菇菌株对纤维素的降解率存在显著差异，OML 对稻秸的纤维降解能力更强。在干物质降解方面，OM1-1 和OMJ-1 组DMD 低于同品种其他时期，而72 h 总产气量和TVFA 浓度保持较高水平，这可能与较高的CP 以及适宜的NDF 含量有关，可保证足够底物供瘤胃微生物发酵，从而提高瘤胃发酵产物含量；另一方面，不同发酵底物的NFC/NDF 也会对瘤胃微生物区系组成产生影响，有研究指出该比例为1.61 时更适合瘤胃发酵[22]。因此，从菌糠营养角度出发，在CP 含量和纤维降解特性方面，OML 品种优于OMJ 和OM1。

表4 不同稻秸平菇菌糠营养成分分析（风干基础）

3.2 不同稻秸平菇菌糠体外发酵特性 pH 是瘤胃内环境的重要指标，瘤胃微生物繁殖适宜的pH 范围为6.0～7.0[23]。NH3-N 作为瘤胃氮代谢过程外源及内源含氮物质分解的终产物，是合成微生物蛋白及机体蛋白的主要原料。Owens 等[24]研究指出，瘤胃微生物合成菌体蛋白所需的NH3-N 浓度范围为0.35～29 mg/dL。本试验各组体外瘤胃发酵液pH（6.59～6.86）和NH3-N 浓度（5.31～9.80 mg/dL）均位于正常范围，说明瘤胃发酵液pH 和NH3-N 浓度适合微生物生长和微生物蛋白合成，OM1-1、OMJ-1 和OML-0 组pH 均显著低于同品种其他时期，而NH3-N 浓度和72 h 总产气量均显著高于同品种其他时期，这与营养指标中CP 含量的变化趋势一致，原因可能是OM1-1、OMJ-1 和OML-0 组菌体代谢活动旺盛，产生更多的菌体蛋白和可溶性碳水化合物，促进瘤胃微生物吸收利用，产生NH3-N 和VFA 等代谢物，从而降低体外发酵液pH[25]。而OML 品种表现为第0 茬NH3-N 浓度显著高于第1 茬和第2 茬，这与OML-0 组CP 含量显著高于OML-1 和OML-2 组的结果一致。VFA 可被瘤胃上皮组织以被动扩散形式、VFA和HCO3-阴离子交换以及电介导等转运途径，为反刍动物持续提供能量[26]，其中乙酸、丙酸和丁酸约占TVFA的95%。瘤胃中VFA 组分差异与发酵底物碳水化合物组分密切相关，OM1-1、OMJ-1 和OML-0 组TVFA 浓度均显著高于同品种其他时期，且乙酸、丙酸、丁酸具有增加的趋势。说明稻秸在发酵过程中，OM1 和OMJ菌糠碳水化合物含量在第1 茬时达到最高，瘤胃微生物代谢产生VFA 含量较多。一般而言，饲粮纤维水平降低有利于乙酸/丙酸比例减小，3 种平菇菌糠都表现为第0 茬NDF 和ADF 含量最高，而OM1-0 和OML-0组乙酸/丙酸比例显著低于同品种其他时期，OMJ-0 组乙酸/丙酸比例具有显著降低的趋势，这与Giger 等[27]的研究结果存在差异，其机理有待进一步研究。

表5 不同稻秸平菇菌糠体外瘤胃发酵特性分析（风干基础）

碳水化合物在瘤胃发酵伴随产生氢，从而转变为氢气，其中溶解态氢是甲烷菌利用二氧化碳合成甲烷的重要前体物质。本研究发现，OMJ-1 与OML-0 组氢气、甲烷及72 h 总产气量显著高于同品种其他2 茬菌糠，且OM1-1 组氢气、甲烷及72 h 总产气量保持在较高水平，说明甲烷菌和其他厌氧真菌对于以上阶段菌糠的活性更强，吸收利用率更高，OM1-1、OMJ-1 与OML-0组菌糠中碳水化合物降解较快，从而产生大量氢气，氢气的生成速率超过甲烷菌对其消耗速率时，导致氢气积累且甲烷产量明显增加[28]。Huang 等[29]报道，用平菇真菌处理稻秸25 d 可改变其气孔率和比表面积等物理性质，分别提高稻秸对纤维素酶和木聚糖酶吸附量18.8%和58.1%，可促进生物甲烷的生成，处理时间较符合本试验中OM1-1、OMJ-1、OML-0 组的收茬时期，且甲烷含量显著高于同品种其他时期。

4 结 论

本试验结果显示，不同收菇次数处理的稻秸平菇菌糠中，OM1 和OMJ 菌糠营养成分含量和体外发酵特性变化规律相似，均表现为第1 茬菌糠CP 含量和体外发酵参数较优，而OML 菌糠表现为第0 茬菌糠CP 含量和瘤胃发酵特性优于后两茬菌糠。整体而言，3 种菌糠随着收茬次数增加，NDF 和ADF 含量不同程度降低。不同品种稻秸平菇菌糠中，OML-0 组营养物质组成优于同一茬次其他2 种平菇菌糠，VFA 各组分比例更加合理，有利于反刍动物瘤胃微生物繁殖，合成微生物蛋白用于机体组成及生理代谢。本研究结果可为进一步筛选平菇真菌发酵稻秸提供数据支撑，同时降解差异机理有待进一步研究。