德州驴冷冻精液定时输精技术与情期受孕率初探

刘 冰，李 敏，李雪贤，尹桂军，王 涛，于 杰，李 楠，杨 峰，刘桂芹，吴帅帅,*

（1.国家胶类中药工程技术研究中心，东阿阿胶股份有限公司，山东东阿 252201；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；3.聊城大学农学院，山东省驴产业科技协同创新中心，山东聊城 252059）

随着驴产业快速发展，我国驴集约化饲养程度也越来越高，但繁殖理论和技术水平落后已成为影响驴产业发展的瓶颈因素[1]。国内外对母驴生殖生理研究较少，驴繁殖技术总体落后于其他家畜。目前，国内外驴的人工授精技术方案主要借鉴马的相关研究，但和母马相比，母驴的发情时间随季节变化而不同，其发情和排卵时间规律难以掌握，增加了配种技术人员的工作难度。对于规模化养驴场而言，只能靠增加技术人员数量，才能在规定时间完成配种任务，但会增加投入、降低经济效益。目前，驴的鲜精人工授精技术在我国部分地方得到推广应用[2]，而有关驴冻精的应用情况在国内未见报道。冻精输精技术是绝大多数家畜遗传改良的主要技术手段[3]。据美国农业部统计，优质种公牛的精液冷冻和人工授精技术对美国奶牛群体遗传改良的贡献高达97%[4]。因此，利用驴的定时输精技术就成为必然趋势。

本实验在规模化、标准化德州驴养殖场内开展驴冻精定时输精试验，以期提高驴冻精使用效率，确保最佳定时输精方法，规范人工授精技术、指导驴养殖业生产，为更深入探讨驴发情期的繁殖机理提供必要参考。

1 材料与方法

1.1 实验仪器 B 超机（KX 5600，5.0 MHz）购自徐州凯信电子设备有限公司；精子电脑数位分析系统（AnDro Vision）购自德国MINITUBE 公司；精子密度仪（RS 232）购自德国MINITUBE 公司；精子程序冷冻仪（Digitcool）购自德国MINITUBE 公司；电热恒温水槽（DK-8B）购自上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验动物 2017—2018 年在山东东阿国家黑毛驴繁育中心（北纬 36°33'，东经 116°25'）筛选253 头3～7 岁健康德州母驴和5 头3～5 岁体格健硕、体重在400～450 kg 的能繁种公驴开展试验。

1.3 公驴冻精制作 通过假阴道法采集种公驴精液，将精液滤除凝胶部分后置于38℃预热的量筒中，读取精液体积。用精子密度仪测量精子密度，先加入3 mL 生理盐水于比色皿中，归零，后于精液液面下中部取120 μL原精液加入比色皿中，混合均匀，测量密度。同时，精液液面以下中间部位取7 μL 原精液置于预热的载玻片上，盖上盖玻片，置于带有38℃恒温板的显微镜下用计算机辅助精子活力分析仪（Computer-assisteD Sperm Analysis，CASA）检测精液活力。每个样本检测5 个视野，记录前进式活力和快速前进式活力。检测密度≥1.5×108个/mL，直线前进运动式活力≥0.7 的精液用于冻精制作。向原精液中按1:1 的比例加入商用马属动物专用稀释液，1 850 r/min 离心10 min，取全部上清液留用。使用精液冻存液重悬精子[5]，使用细管灌装打印机分装精液至0.5 mL 冻精细管中，4℃冷藏柜中平衡2～3 h，使用全自动冷冻仪快速冷冻精子，制作好的冻精规格为每支0.5 mL，总精子数为1 亿个。经随机抽检，38℃水浴解冻30 s 后的解冻活力＞0.35 视为合格，并投入液氮长期保存备用，使用前进行随机抽检。

1.4 外源性GnRH 药物促排处理 繁殖季节内每日10:00，通过B 超机检测试验母驴的卵泡发育情况，具体方法：将母驴保定在四柱栏内，技术人员手戴长臂手套掏净直肠内粪便，手持B 超机探头进入直肠，找到卵巢所在位置，检测卵巢内卵泡大小和观察子宫形态。根据超声波图像取2 条垂直直径的平均值作为卵泡直径。试验选取卵泡直径≥30 mm 的发情母驴51 头，随机分为2 组，其中31 头母驴进行肌肉注射GnRH 药物（由中国农业大学提供）0.8 mL，当天记为第0 天（D010:00）；另外20 头母驴作为对照组，肌肉注射0.8 mL生理盐水。技术人员于D110:00、D120:00、D210:00对2 组母驴进行排卵检测，统计分析不同时间段驴群的排卵率。

1.5 人工授精 将待配母驴的外阴清洗消毒并用无菌擦手纸擦干后，技术人员手戴无菌的长臂手套，将输精管头部攥于手心，手背涂抹无菌的润滑剂后伸入阴道穹隆内，输精管穿过子宫颈进入子宫体。技术人员将佩戴长臂手套的手臂抽出并伸入直肠内。通过直肠把握的方法，将输精管头部引导至与优势卵泡同侧的子宫角处进行输精[6]。当两侧卵巢均存在优势化卵泡时，选择卵泡直径最大的一侧。经B 超检测发现有生殖系统疾病的母驴不进行配种。

1.6 驴冻精不同输精方法

1.6.1 单次输精时，不同输精时间点及输精剂量对母驴情期受孕率的影响 参考马属动物输精后建立输卵管精子库的时间[7]，结合1.4 中GnRH 药物促排卵规律性，本研究在驴群集中排卵发生前的4 h（D116:00）、2 h（D118:00）、0 h（D120:00）分别对母驴群开展不同输精剂量的单次输精试验（10、5、2 支/头）。

1.6.2 2 次输精时，不同输精剂量对母驴情期受孕率的影响 参考GnRH 药物促排卵的规律性，试验将单次输精法改为2 次输精法，具体方法为将在D120:00 的单次输精改为在D120:00 和D204:00 各进行1 次输精。根据2 次输精中分别使用的冻精细管支数n1、n2，将试验组记为n1+n2组。本试验的分组记为5+5 支组（31 头）、2+2 支组（32 头）、1+1 支组（21 头）。

同时，考虑到自然状态下母驴群无法实现集中发情配种，试验将规定时间内发情、排卵并采用同一方法输精的母驴视为同一试验组。试验在第1 次输精前和D212:00 对输精母驴进行排卵检测，提前排卵和未排卵母驴不计入试验组。

1.7 妊娠诊断 妊娠诊断在输精母驴排卵后的第14 天进行，排卵后16 D 进行复检妊娠状况[8]。未孕母驴进入下一次发情期后，继续参与后续试验。

1.8 统计分析 采用SPSS 20.0 软件中的卡方检验对所得数据进行显著性检验分析。P＜0.05 代表差异显著。

2 结果

2.1 外源性GnRH 药物注射对母驴情期排卵的影响 卵泡直径≥30 mm 的母驴经GnRH 药物处理后在不同时间段的区间排卵率如表1 所示，GnRH 注射组34～48 h（D120:00—D208:00）排卵率高达80.65%，显著高于对照组。而＞48 h 时，对照组的排卵率与GnRH 注射组无显著差异。

表1 经GnRH 药物处理后母驴在不同时间段的区间排卵率

如图1 所示，在34～48 h 每2 h 的排卵率分布为4.00%（1/25）、12.00%（3/25）、24.00%（6/25）、28.00%（7/25）、20.00%（5/25）、8.00%（8/25）、4.0%（1/25），各时间段无显著性差异。

图1 GnRH 处理后34～48 h 不同时间段的排卵率分布

2.2 单次输精法的情期受孕率研究 如图2 所示，在D116:00，不同冻精细管使用支数（10、5、2 支/ 头）对应的情期受孕率分别为13.64%（3/22）、9.52%（3/21）、10.53%（2/19）。在D118:00，不同冻精细管使用支数（10、5、2 支/头）对应的情期受孕率分别为21.05%（4/19）、15.38%（4/26）、13.04%（3/23）。D120:00 不同冻精细管使用支数（10、5、2 支/头）对应的情期受孕率分别为29.41%（10/34）、23.81%（5/21）、14.71%（5/34）。输精时间距集中排卵期（D120:00—D210:00）越近，母驴单次输精后的情期受孕率呈增加趋势。但可能因为参与试验的样本少，导致试验中各组情期受孕率无统计学差异。同一时间点内，随着输精剂量增加，母驴情期受孕率出现升高趋势，但各组间无统计学差异。

图2 情期单次输精时不同输精支数和时间对情期受孕率的影响

2.3 2 次输精法的情期受孕率影响 如表2 所示，随着输精支数的增加，情期受孕率呈上升趋势。其中，5+5 支组、2+2 支组、1+1 支组的情期受孕率分别为35.48%、31.25%、19.05%，组间无显著差异。同样输精剂量下，多次输精情期受孕率较单次输精时的情期受孕率高。其中，5+5 支组的情期受孕率显著高于2 支组。

表2 输精方法和冻精细管使用支数对情期受孕率的影响 %

3 讨 论

目前，驴排卵时间主要依据直肠检查卵泡大小、形态及软硬程度来综合判断[9]。但对于卵泡软硬程度的触感与排卵时间的判断主要依赖于技术人员个人经验，同时考虑到母驴发情和排卵易受季节和外界环境（如温度、光照等）影响[10]，母驴的排卵时间很难准确把握。因此，首先需要从母驴的发情规律入手，了解其内分泌特点，然后根据卵泡和子宫条件，使用外源激素控制排卵进程，达到定时输精目的[11]。本试验结果显示，在德州驴规模化养殖场中卵泡直径≥30 mm 的母驴在肌肉注射GnRH 药物后的34～48 h 内集中排卵，区间排卵率大于80%。对母驴排卵区间的准确控制为冻精定时输精技术奠定了基础。

精卵结合形成合子的过程即为受精，有受精能力的精子和卵子在受精过程中缺一不可。驴鲜精输精时间与排卵时间间隔不超过48 h 时，驴的情期受孕率（40%左右）不受影响，且驴鲜精隔日输精技术已在实际生产中得到应用[2,5]。与鲜精、低温冷藏精液不同的是，尽管驴冷冻精液具有良好的解冻后活力[12-14]，但本试验中冻精最佳情期受孕率（35.48%）仍低于鲜精（40% 左右）[2]；目前关于驴冻精在母畜体内保持受精能力的时间并没有明确结论。Samper 等[15]研究发现冷冻保存的马精子输精后到达输卵管速度以及与输卵管上皮的结合能力都弱于鲜精，而引起的炎性反应强于鲜精[16]。同时，相比于鲜精，冷冻精液的制作过程会损伤精子机能，影响精子库的正常建立，缩短了输入母马体内的精子保持受精能力的时间，这些现象都说明冻精体内存活时间短于鲜精。基于上述原因，通常认为冻精输精时间要尽可能接近排卵时间，这样才可能获得较好的情期受孕率。母马研究表明，在输精4 h 后就可以在输卵管建立精子库，且冻精输精时间和排卵时间不超过±12 h 时，可以得到令人接受的情期受孕率。驴繁殖从业者实践发现，冻精输精时间距离母驴排卵时间±8 h 内可获得较好的受孕率。本研究也发现输精时间越接近驴群集中排卵期时，驴群的情期受孕率呈上升趋势。

根据Seime 等[17]的研究理论，当发情期内的输精时间固定后，母畜发生多次排卵有利于情期的受孕，这是因为多次排卵发生时间接近输精时间的概率要大于单次排卵。根据以上理论，笔者推测当母驴排卵发生在确定的时间范围内时，2 次输精时间接近排卵时间的概率大于单次输精，因此2 次输精有可能对情期受孕率有利。对此，本研究选择在D120:00 和D204:00 进行2 次定时输精，旨在使精子保持受精能力的时间尽可能涵盖整个集中排卵区间，结果发现，试验5+5 支组、2+2 支组的情期受孕率均大于30%，高于10 支组（29.41%）、5 支组（23.81%），但差异并不显著。单次输精改为2次输精后得到了较为理想的情期受孕率，与Avanzi 等[18]研究结果一致，但可能因为参与试验的样本少，经统计学分析后各组受孕率无显著差异。

在母马的宫腔镜输精试验中发现，精子库中精子需维持一定数量才能实现其高效受精能力，当精子量低于这个阈值时，受精能力会降低。本试验也发现，冻精输精时间接近排卵时间时，输精支数由10 支降为5、2 支时，情期受孕率随之下降。2 次输精中，1+1 支组的情期受孕率仅为19.05%，低于2+2 支组（31.25%）和5+5 支组（35.48%），表明输精次数和输精计量都会对情期受孕率产生影响。因此，笔者认为对健康母驴发情周期进行监控、预测排卵的同时，还需及时将足够数量、一定活力的精子导入子宫内，这些是决定人工授精成功关键因素。

4 结 论

综上所述，进行驴的冻精输精时，要求尽量缩短输精时间与排卵发生时间的间隔。通过药物对母驴排卵时间的准确掌握，为冻精定时输精技术奠定了基础。发情母驴经GnRH 药物促排处理后，采用2 次定时输精法可以实现在提高冻精利用效率的基础上，获得较为理想的情期受孕率，适用于规模化养殖场。