Cry1 基因在雄性绵羊生殖轴系的表达与定位

2021-03-15王守法赵淑琴刘彩萍张彩霞祝莉萍汪瑞龙

中国畜牧杂志 2021年3期

王守法，赵淑琴，刘彩萍，张彩霞，韩乐，祝莉萍，汪瑞龙

（1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070；2.甘肃农业大学基础实验教学中心，甘肃兰州 730070）

已有研究表明，Cry1 蛋白在人和小鼠的垂体、肝脏、性腺等组织中广泛表达[8]。罗万伟等[9]研究发现，Cry基因在不同年龄段的绵羊垂体中均有表达。Cry1 蛋白在30 日龄牦牛睾丸中的表达量最低，随着年龄的增长表达量逐渐增高[10-11]。研究哺乳动物生物钟节律基因的表达对分析动物的季节性发情意义重大。但目前对Cry1 蛋白在绵羊生殖轴系中表达定位的报道较少。本实验对发情期绵羊生殖轴系中Cry1 蛋白的表达进行了研究，对Cry 蛋白进行生物信息学分析，为分析动物繁殖与生物钟之间的联系提供了重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料样品采自于甘肃省兰州市小西湖屠宰场，选健康成年雄性绵羊6 头，颈部放血致死，采集松果体、下丘脑、垂体、睾丸和附睾组织，将这些组织分成2 份，一份置于液氮中保存，另一份置于10% 的福尔马林中保存。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂免疫组化实验所用到的抗体：一抗rabbit anti-CRY1，二抗Affinipure goat anti-rabbit IgG、rabbit anti-β-actin、免疫组化试剂盒均购自北京博奥森生物公司；RNA 提取试剂盒、蛋白Marker、cDNA 反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMII 试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；高效RIPA 裂解液（组织/细胞）、Lowry 法蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝公司。

1.2.2 仪器 AO-820 组织切片机（Reichert，美国）；HI1210 摊片机（徕卡，上海）；实时荧光定量PCR 仪LightCycler96（Roche，瑞士）；微型垂直电泳槽、电转印槽（伯乐公司，美国）；DP71 显微镜（Olympus，日本）。

1.3 实验方法

1.3.1 Quantitative RT-PCR 反应各组织中RNA 的提取严格按照RNA 提取试剂盒说明书进行操作，并用超微量核酸蛋白测定仪测定RNA 浓度，用0.1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。反转录严格按照cDNA反转录试剂盒说明书进行操作，合成cDNA 链，保存于-20℃冰箱备用。所用引物设计参考罗万伟等[9]，其序列号为Cry1（NM_001129735）、内参基因GAPDH（NM_001190390）。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

计算完毕后，比较竣工和设计标高差异值。其中在公式（2）中的可以直接作为实际施工立模标高。正向分析法主要是按照实际施工的步骤顺序进行桥梁施工数据的分析测算，合理解决了传统的倒装分析法不可避免的桥梁连续施工混凝土收缩不变的计算问题[3]。假设在实际计算过程中，桥梁施工单位在第一阶段应力并没有通过，也可以及时进行调整。此外，正向分析法可以充分考虑设计资料和相应施工方案，对桥梁结构工程、施工工作以及后续的工程监管融为一体，保证监管工作的现实性和针对性。

表1 引物序列

以cDNA 为模板，qPCR 反应总体系为20 μL：模板1 μL，SYBR®Premix Ex TaqTMII 10 μL，0.05 μmol/μL上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。每个样品设3 个重复。扩增条件为94℃预变性5 min；94℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，循环次数45 次[12-13]。所得相关数据用2-ΔΔCt方法进行计算，每个基因相对表达量均以内参基因为基准进行校正。qPCR 结果用3 次重复实验“平均值±标准误”表示（X±SEM），所有数据用SPSS 18.0 软件进行One-way ANOVA 显著性分析，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著，用GraphPad Prism 5 作图。

1.3.2 用免疫组织化学定位方法检测蛋白分布参照Lincoln 等[14]的免疫组织化学法，检测Cry1 蛋白在各组织中的表达定位，具体步骤如下：将常规石蜡切片65℃烤片1 h 后进行脱蜡处理，之后用PBS 洗3 次，每次5 min。再将切片置于枸橼酸缓冲液中高压修复1 min，自然晾至室温后用PBS 洗3 次，每次3 min。用3%H2O2湿盒孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性，用PBS冲洗5 min。滴加封闭液，室温湿盒孵育30 min，倾去。滴加anti-Cry1 一抗，稀释比例为1:400，对照组用PBS代替。4 ℃湿盒孵育过夜。PBS 洗3 次，每次3 min。滴加二抗，不需要稀释，室温湿盒孵育60 min，PBS洗3 次，每次5 min。滴加1 滴DAB 工作液进行显色，显微镜下控制反应时间，约5 min，用蒸馏水终止反应。苏木精复染5～8 min（时间视显微镜观察结果来定），0.1% HCl 分化，自来水冲洗，切片经梯度酒精脱水干燥后二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后用Olympus DP71 显微镜观察并照相。

1.3.3 Western blotting 分析将组织用液氮研磨成糊状后，称取20 mg 加入250 μL 蛋白裂解液，用涡旋混匀器混匀后，10 000 r/min 4℃离心15 min，取上清[15]，用Lowry 法蛋白浓度测定试剂盒对上清中的蛋白含量进行检测，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。剩余蛋白上清分装后冻存至-80℃冰箱中。

Western blotting 步骤参照文献报道的方法进行[16]。分离胶浓度为10%，蛋白上样量为30 μg，相应的一抗（按1:1 000 的比例溶解于含5%脱脂奶粉的TBST 溶液）4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶（HRP）标记相应的二抗（按1:8 000 的比例溶解于含5% 脱脂奶粉的TBST 溶液）室温孵育2 h。用PBS 在摇床上洗涤2 h，中间多次更换PBS。用高灵敏度化学发光液ECL 检测试剂盒显影结果，用X 胶片曝光并进行拍照。

1.3.4 生物信息学分析登录表2 所列网址[17-19]，在序列搜索栏中输入从NCBI 获取的Cry1 蛋白质序列（XP_012014825.2），对蛋白质理化性质、亲水性、信号肽、跨膜结构、结构域、磷酸化位点、糖基化位点、亚细胞定位、二级拓扑结构、三级结构和蛋白的同源性进化分析等作出预测。

2 结果与分析

2.1Cry基因在雄性绵羊生殖轴系各组织的定量检测qPCR 结果显示，雄性绵羊生殖轴系各组织中均有Cry1基因的表达。Cry基因在下丘脑中的表达最高，其次为睾丸，在垂体中表达最少。以垂体为参照，各组织中Cry1基因的相对含量与垂体相比差异显著（图1-a）。Western blotting 结果印证了qPCR 结果，Cry1 蛋白在整个生殖轴系均有表达，在下丘脑中的表达最高（图1-b）。

2.2 Cry1 蛋白在雄性绵羊生殖轴系各组织中的表达HE 染色结果显示，雄性绵羊各组织细胞形态正常，为健康动物（图2-a1～e1）。免疫组化实验结果显示，对照组背景都为蓝色阴性（图2-a2～e2），anti-Cry1 实验组在各个组织中均出现免疫反应阳性产物（黄色或棕色）。在松果体中，松果体细胞占细胞总数的90%左右，其余主要为神经胶质细胞。anti-Cry1 实验组显示Cry1蛋白在松果体中呈弥散性表达，细胞核、细胞质和细胞膜均呈阳性表达，且着色较深（图2-a3）。在下丘脑中，胞体呈不规则的圆形、卵圆形、梭形、三角形和多角形等。实验组免疫反应阳性神经元呈深浅不等的棕黄色，胞核、胞质和胞膜均呈阳性反应（图2-b3）。在垂体结节部中，anti-Cry1 主要在纵形毛细血管及索状纵向排列于血管间的腺细胞表达（图2-c3）。睾丸组织切片经免疫组化染色后，免疫阳性物质均主要分布在睾丸的基膜和间质细胞中（图2-d3）。在附睾上，管腔上皮细胞、管周肌样细胞和腔面精子呈阳性表达（图2-e3）。结果显示在下丘脑-垂体-性腺轴上都有Cry1 蛋白的存在，暗示生物钟基因在动物的繁殖发育上发挥重要作用。

表2 生物信息学分析登录网址

图1 Cry1 基因在雄性绵羊生殖轴系各组织的定量检测

图2 Cry 蛋白的免疫组化结果

2.3 生物信息学分析

2.3.1 Cry1 蛋白理化性质及亲水性分析使用Protparam在线软件预测Cry1 蛋白的理化性质，结果显示Cry1 蛋白由587 个氨基酸组成，分子量为66.4 kDa，理论等电点是8.27，半衰期是30 h，消光系数（280 nm）是124 175，肽链N 端是蛋氨酸，为不稳定蛋白，脂肪系数是79.78。

使用ProtScale 在线软件预测Cry1 蛋白的亲水性，预测结果如图3 所示，0 值以上用来表示疏水区，该区段的分值越高则表示所测蛋白的疏水性越强，0 值以下用来表示亲水区，该区段的分值越低，则表示所测蛋白的亲水性越强。Cry1（-0.391）为亲水性蛋白质。

图3 Cry1 蛋白亲水性分析

2.3.2 蛋白质磷酸化位点及糖基化位点预测使用NetPhos 3.1在线软件预测Cry1 蛋白磷酸化位点，结果如图4 所示，Cry1 蛋白的氨基酸序列上存在53 个磷酸化位点，其中位于丝氨酸（Ser）的有33 个，位于苏氨酸（Thr）的有14 个，位于酪氨酸（Tyr）的有6 个。Cry1 蛋白的糖基化位点有23 个。

图4 Cry1 蛋白的磷酸化位点预测

2.3.3 蛋白质信号肽、跨膜域及二级拓扑结构分析通过预测发现Cry1 蛋白无信号肽信息，表明该蛋白不是分泌蛋白，且Cry1 蛋白不存在跨膜结构。Cry1 蛋白二级结构元件有α螺旋229 个（39.08%）、无规卷曲258个（44.03%）、伸展链63 个（10.75%）、β-转角36个（6.14%）。

2.3.4 Cry1 蛋白的亚细胞定位及蛋白保守结构域预测Cry1 蛋白主要位于细胞质（52.2%）、细胞核（21.7%）、分泌囊泡（4.3%）、细胞骨架（4.3%）。Cry1 蛋白含有1 个DNA 裂解酶的FAD 结构域，存在于288～486位氨基酸；还有1 个PhrB 超家族结构域，存在于6～491 位氨基酸（图5）。

图5 Cry1 蛋白保守结构域分析

2.3.5 Cry1 蛋白三级结构预测 Cry1 蛋白建模模板为4k0r.1.A，其相似性为95.90%，可信度为97.62%（图6）。

图6 Cry1 蛋白三级结构预测

2.3.6 不同物种Cry1 蛋白的进化分析通过同源性比对分析发现（图7），与羊的Cry1 氨基酸序列最为相近的动物是牛，同源性为99.1%，之后依次为鹿（98.6%）、猪（98.1%）、狗（98.0%）、猫（97.7%）、马（97.2%）、鼠（95.4%）、鸡（92.5%）、人（90.3%）。由图8 可见，绵羊的Cry1 氨基酸序列与牛和鹿最为接近。

3 讨论

通过qPCR 和Western blotting 实验显示，雄性绵羊生殖轴系各组织中均有Cry1基因的表达，因此暗示Cry基因通过下丘脑-垂体-性腺轴参与哺乳动物生殖调控。Cry1在下丘脑中的表达最高，但这一结果与高磊等[20]在绵羊性腺轴上Cry基因表达的结果不相符，其结果为松果体中Cry基因的表达量明显比其他组织的表达量高。但本研究结果与生物钟基因主要存在于下丘脑的视交叉上核的结果相印证[1]。

图7 Cry1 氨基酸序列的同源性比对

图8 Cry1 氨基酸序列的系统进化树

通过免疫组织化学实验结果表明，Cry 蛋白在雄性绵羊松果体及生殖轴系中均广泛表达，与qPCR 的结果相一致。在松果体和下丘脑中，Cry 蛋白成弥散性表达，胞膜、胞质及胞核均有阳性表达。在垂体上Cry 蛋白主要位于毛细血管的管壁细胞和血管周围的腺细胞上，这说明血液中的某些成分对Cry 蛋白有很大影响。在睾丸上，Cry 蛋白主要位于睾丸的基膜和间质细胞。在附睾上，Cry1 蛋白在管腔上皮细胞、管周肌样细胞和腔面精子上呈阳性表达，这说明Cry 蛋白在精子经过附睾的过程中，对其发育成熟发挥较大作用。有研究表明，与正常小鼠相比，Cry1基因敲除小鼠的精细胞发生改变，凋亡数目明显增加，数量明显减少，但血清睾酮浓度改变不明显[21]。Bur 等[22]证明了Cry1和Cry2作为昼夜节律钟的组成部分，对于维持雌性和雄性小鼠的性别二型性是必要的，具体来说，双突变体Cry1-/-Cry2-/-雄鼠不能按需表达雄激素，其性激素水平与雌鼠相似，同时敲除Cry1与Cry2基因小鼠的生物钟节律则完全丧失。

通过生物信息学分析发现，Cry 蛋白为碱性蛋白质，为亲水性蛋白质，无信号肽信息和跨膜结构，主要的二级结构元件是α 螺旋和无规卷曲。亚细胞定位结果显示Cry1 蛋白主要位于细胞质和细胞核中。构建系统进化树发现绵羊的Cry1 蛋白与牛、鹿的分子进化距离最近，说明其亲缘关系最为密切。蛋白质的结构决定功能[23-24]。为保证预测分析的准确性，本实验采用了多种分析软件，虽然各种软件的原理和算法有所不同，但是结果的相似性极高，说明预测结果具有较高的可信度。

有文献报道[25]，只敲除小鼠的Cry1基因，或者只敲除小鼠Cry2基因，小鼠的生物钟节律没有被损坏，并且小鼠的SCN 核团依然维持着完整的转录-翻译负反馈环路。敲除Cry1基因后，小鼠不论在行为水平还是在主时钟的调控水平上表现出的生物钟节律为短周期。敲除Cry2基因后，小鼠的生物钟节律表现为长周期。如果同时敲除Cry1基因与Cry2基因，小鼠的生物钟节律则完全丧失[25]。研究还发现在细胞中过表达Cry基因后，其翻译出的Cry 蛋白增多，CLOCK 和BMAL1 异二聚体的转录活性会被Cry 蛋白抑制[26]。可见，Cry1基因对生物钟的稳定性发挥着至关重要的作用。本实验成功得出Cry1基因在雄性绵羊生殖轴各组织中均有表达，在下丘脑中的表达最高，睾丸次之，在睾丸组织的基膜和间质细胞，以及附睾管腔上皮细胞、管周肌样细胞和腔面精子上呈阳性表达。