胆总管结扎诱导大鼠肝肺综合征模型的建立初步研究*

荣海芳，王立国

肝肺综合征(hepatopulmonmy syndrome，HPS)是指在慢性肝病或门静脉高压等基础上形成的以低氧血症为主要临床特征的一种病症[1]，是终末期肝硬化最严重的并发症，成人终末期肝病HPS患病率为4%～47%[2]，发病机制未完全阐明，治疗效果差，病死率高。目前，多数研究认为多种血管活性物质和细胞因子参与了肺微血管内皮细胞的增殖和微血管扩张，并促进了HPS的发生[3]。有关HPS的临床研究较少，多数以动物实验研究为主。因此，良好的动物模型的建立尤为重要。一个理想的动物模型应具备模型形成率高、动物死亡率低、重复性好、方法简单且与人类疾病特征相似等特点。HPS模型的建立应该首先建立肝硬化动物模型。目前，对于肝硬化模型的建立主要包括四氯化碳、化学致癌物、乙醇、血吸虫感染和手术等，各有利弊。由于胆汁淤积及胆汁酸的毒性作用，肝细胞可出现进行性损伤，最终可发展为肝硬化甚至肝衰竭，胆汁淤积性肝损伤是肝纤维化和肝硬化重要的危险因素[4,5]。大量动物实验证明，通过胆总管结扎术式可诱导肝硬化形成，而且只有胆总管结扎术能形成HPS模型。因此，建立胆总管结扎术诱导HPS形成的动物模型具有很高的研究价值。本文采用胆总管结扎术诱导大鼠HPS模型，详细介绍了制备过程，并通过血液、超声和组织病理学检查等多方面进行模型验证，发现该术式具有手术时间短、切口小、造模周期短、稳定性高、不易自发逆转等优势，可作为HPS基础研究的模型应用。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器和试剂 SD大鼠40只，体质量在180～250 g之间，购自青岛派特福德白鼠养殖专业合作社[实验动物生产许可证编号：SCXK(鲁)20130001，实验动物使用许可证编号：SYXK(黑)2011007]；美国 RADISM ETER 公司生产的 ABL700血气分析仪；使用加拿大Sonix OP超声诊断系统；上海研卉生物科技有限公司提供的检测血一氧化氮(nitric oxide，NO)试剂盒；检测肝纤维化指标的ELISA试剂盒购自上海研吉生物科技有限公司。

1.2 动物模型的制备 采用随机数字表法将大鼠分为胆总管结扎组30只和假手术组10只。术前禁食8 h，在动物实验室手术操作台上先用4%水合氯醛1 ml/100 g腹腔内注射麻醉，固定(图1)。腹部备皮、消毒。沿腹白线开腹，在剑突下1 cm处行纵行小切口，于胃窦寻找十二指肠降段，分离胆总管(图2)。用4-0线在胆总管末端双线结扎(图3)，清理手术器械后逐层关腹；在对照组，不结扎胆总管，其他步骤同前。术后，待动物苏醒后分笼饲养，注意保温和局部换药。于术后1 w、2 w、4 w、5 w和6 w各处死2只实验组和对照组大鼠，观察肝肺和胆总管组织结构。经左心室采血2 ml，以5000 r/m室温离心15 min，取上层血清。

图1 动物模型制备 固定手术操作台

图2 动物模型制备 寻找并分离胆总管

图3 动物模型制备 双线结扎胆总管

1.3血清检测 使用全自动生化分析仪检测肝功能指标；采用ELISA法测定血清透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层粘连蛋白 (laminin，LN)、III型前胶原肽(procollagen Ⅲ N-terminal peptide ，PCⅢ)和IV型胶原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)水平。

1.4 血气分析和血浆NO水平测定 使用血气分析仪测定PaO2、PaCO2和pH；采用硝酸还原酶法测定血清NO含量。

1.5 腹部超声检查 使用超声诊断仪检测肝脏表面形态和胆总管宽度。

1.6 病理学检查 取大鼠肝脏和肺脏组织各约1 cm3，常规脱水、包埋、切片，行HE染色，光镜下观察。

2 结果

2.1 大鼠HPS动物模型建立成功 在胆总管结扎术后4～6 w，动物形成肝硬化，部分并发HPS。在术后3 d，对照组动物活动量基本恢复，而实验组大鼠活动迟缓，并逐渐出现毛发失去光泽、皮肤和尿液变黄(图4)、体质量下降。至2 w后，这种现象更加显著。术后1、2、3、5、6 w分别处死两组大鼠各2只，发现实验组动物肝脏逐渐增大，质地变硬，至4 w时胆总管扩张、增宽，表面见纤维条索并出现颗粒样结节(图5)。在6 w后，大鼠活动后气促、呼吸困难，部分大鼠出现腹腔积液(图6)；10只对照组大鼠均无死亡，而术后3 d、7 d和10 d，30只实验组大鼠死亡11只(27.5%)。死亡原因包括麻醉意外、腹腔出血、胆管破裂、急性肝衰竭。

图4 术后1w大鼠精神萎靡，活动迟缓，尿色加深

图5 术后5 w肝脏表面粗糙不平，并见颗粒样结节

图6 术后4周见腹腔积液

2.2 两组肝功能和肝纤维化指标比较 实验组大鼠随胆管结扎时间的延长，血清TBIL逐渐升高，术后2 w达高峰，以后胆红素仍缓慢升高。血清AST和ALT逐渐升高，第3 d达峰值，随后稍有下降，2 w后平稳，至4～6 w呈下降趋势。术后第1 d血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C水平逐渐升高，至4 w达到峰值，以后逐渐平稳；对照组动物血清肝功能指标无显著变化。

2.3 大鼠HPS建模成功 在术后1 w、2 w、4 w和6 w，动态观察血气分析结果表明，实验组动物动脉血PaO2显著低于对照组，而PaCO2逐渐升高，血浆NO水平在术后1 w逐渐升高，至4 w达到峰值，显著高于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 各组动脉血气分析和血浆NO水平比较

2.4 腹部超声检查情况 腹部超声检查发现实验组术后1 w动物肝脏回声增粗，胆总管轻度扩张；在术后2 w，肝脏被膜不平整，胆总管显著增粗；在术后4～6 w，肝脏被膜不平整，部分表面可见小结节形成，胆总管显著增宽，并可见腹腔积液。

2.5 组织病理学表现 在4 w后，可见实验组动物肝组织炎症细胞浸润，纤维条索和部分假小叶形成(图7)；在6 w后，肺脏组织见肺微血管显著扩张(图8)。

图7 肝组织病理学变化 在术后4 w，实验组动物肝组织炎细胞浸润，肝细胞排列紊乱，结缔组织增生，部分假小叶形成(HE，400×)

图8 肺组织病理学变化 在术后6 w，肺组织微血管扩张，可见少量红细胞位于肺泡壁及其腔内(HE，400×)

3 讨论

HPS是终末期肝硬化最严重的并发症，其病因目前不清，治疗效果差，病死率高。目前，HPS的发病机制已成为国内外研究的热点。对于HPS的发病机制研究主要集中在动物实验上，因此一个良好的动物模型的建立显得至关重要。HPS必将要经历肝硬化阶段，目前对于肝硬化动物模型的建立包括四氯化碳、二乙基亚硝胺等化学毒物[6]、化学致癌物、血吸虫、手术等，还有报道将不同浓度的四氯化碳注射联合饮用乙醇诱导大鼠肝肺综合征模型，可显著提高肝硬化模型的造模成功率[7]，但真正能诱导形成HPS的只有胆总管结扎术[8]。

自1872年首次应用胆总管手术建立动物模型以来，一直被推举为研究进行性肝损伤的经典模型。凭借简单、快速、有效等优点，广泛用于进行性肝病的多方面研究[9,10]。胆总管结扎术也是HPS模型诱导的经典术式，并被广泛应用于实验研究[11]，具有造模周期短、稳定率好等特点。结扎方法包括单纯结扎肝外胆管法、胆管结扎后切断法和逆行性注入N-丁基-2-氰基丙烯酸盐法三种方法[12-14]。我们的研究认为，一般大鼠在胆总管结扎术后胆总管进行性扩张，在2周后形成肝纤维化，4周形成肝硬化，而在6周左右形成HPS模型，大鼠死亡率为27.5%，死亡原因有麻醉意外、腹腔出血、胆管破裂、急性肝衰竭等。HPS模型的建立对于无动物实验基础的研究者来说较为困难，需不断地摸索。我们认为需注意以下几点：(1)需有备用大鼠，以防大鼠死亡较多，影响实验进程；(2)大鼠难抓，我们用矿泉水瓶自制了捕鼠器，可以很好地解决这个问题；(3)多主张腹腔麻醉，以水合氯醛为首选，经济易得且效果好；(4)在胆总管结扎后，不建议离断胆总管，否则容易引起胆管破裂后腹膜炎，影响观察，或切断胆管后出现严重的胆汁淤积，引起急性肝坏死，动物死亡率高[15]。因此，只建议用手术缝线紧密双重结扎即可，胆管再通发生率非常低；(5)术后第1天非常重要，大鼠很容易死亡，需加强保暖和观察。

在胆总管结扎术后，随着时间的延长，实验组大鼠逐渐出现一系列与胆汁淤积性肝硬化患者相似的症状、体征和血清学改变。我们的研究发现大鼠出现精神萎靡、行动迟缓、尿色变黄、毛发黄染无光泽，在4周后部分实验组大鼠出现腹腔积液。血清胆红素和转氨酶进行性升高，在2周后达到高峰，在4周后趋于平稳，血清肝纤维化指标逐渐升高，证明胆总管结扎引起了进行性肝脏损害，与既往文献报道相一致[16-18]。

大鼠HPS建模成功的重要指标包括动脉血气分析提示低氧血症,血浆NO水平升高[19],组织病理学见肺微血管扩张。其中低氧血症是重要的标志性指标，但低氧血症的基础是肺微血管扩张[20]，而各种原因引起的NO增多是其发生发展的重要原因[21，22]。我们的实验也证实了这一点。在胆总管结石术后4周，肝脏组织病理学表现为炎细胞浸润，肝细胞排列紊乱、假小叶形成，肺血管内皮细胞扩张，证明肝硬化形成。在6周时，大鼠行动迟缓，呼吸困难，动脉血氧分压显著下降，二氧化碳分压升高，血浆NO水平进行性升高，与对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。同时，我们的实验还表明，在HPS模型形成过程中，彩色多普勒超声同样是一个重要的检测手段，具有微创、准确、快速、方便等特点。它可动态观察大鼠肝脏和胆总管的变化情况。