生长抑素通过抑制内质网应激反应减轻肝纤维化小鼠肝损伤研究*

都庆国，陆建文，王建华，龙延滨，薛 飞

肝纤维化(liver fibrosis，LF)是病毒、药物、炎症、脂肪沉积等病因刺激下发生的可逆性的肝脏损伤修复反应，其本质是肝脏损伤后细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的沉积过程，导致有功能的肝脏实质被瘢痕组织所替代，并且刺激肌纤维母细胞增殖活化，进一步产生大量的胶原蛋白和未折叠蛋白质[1-3]。内质网(endoplasmic reticulum，ER)作为真核细胞重要的细胞器，主要参与蛋白质的合成、加工、修饰、折叠、运输等一系列生物学过程。当大量的胶原蛋白产生时，内质网启动应激机制，即内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反应，以促进细胞存活。但若应激持续存在，细胞将启动凋亡程序，并加速肝纤维化的发生。因此，通过抑制ERS反应减轻肝脏损伤，控制细胞凋亡是延缓肝纤维化进展的重要途径。有研究发现，生长抑素(somatostatin，SST)可以通过减轻肝脏炎症降低肝酶、减轻肝损伤，但是关于SST是否能够通过减轻肝脏损伤抑制ERS反应，并进一步减缓LF形成，未见相关研究报道。本实验以四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导小鼠LF动物模型，观察了SST对ERS和凋亡相关蛋白表达的影响，以探讨SST是否能通过抑制ERS反应减轻肝脏损伤，控制LF进展。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 40只10周龄健康野生型C57BL/6小鼠，雌雄不限，体质量(25±3)g，购于上海必凯实验动物有限公司。CCl4、oil、二甲苯、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、天狼星红染色液、PBS均购于国药集团化学试剂有限公司；注射用SST由瑞士默克雪兰诺公司生产；抗I型胶原(collagen I)购于Southern Biotech；抗Bcl-2、抗Bax、抗CHOP购于Santa Cruz；抗BiP、抗Caspase-9(Casp-9)、抗HSC70抗体购于Abcam；二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。蛋白裂解液(RIPA)、蛋白酶抑制剂(PI)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、ECL-化学发光试剂盒、蛋白上样缓冲液、BSA、DAB显色液购自上海碧云天公司。

1.2 LF动物模型的建立 将40只小鼠随机分为对照组(oil)、模型组(CCl4)、小剂量SST干预组(CCl4+SST-L)和大剂量SST干预组(CCl4+SST-H)，每组10只。除对照组外，给予其余各组小鼠25% CCl4橄榄油混合液10μl.g-1腹腔注射，2次/w；在干预组，分别给予SST 10 μg.kg-1和20 μg.kg-1皮下注射，2次/d；在对照组和模型组，给予等量生理盐水皮下注射。造模观察8 w后，处死动物，取血1 mL，离心取上清、冻存。取小鼠肝脏，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，将余肝组织液氮冻存。石蜡切片行天狼猩红染色和免疫组化染色。在10倍和20倍镜下，随机选择每张切片5个视野。根据Ishak评分分析肝组织纤维化和胶原蛋白含量。按炎性改变程度，给予对应的评分：碎屑样坏死(0～4分)；融合性坏死(0～6分)；点状坏死(0～4分)；汇管区炎症(0～4分)。根据肝纤维组织沉积程度，给予对应的评分(0～6分)。

1.3 血清肝功能检测 测定血清AST和ALT水平。

1.4 肝组织蛋白表达检测 取约20 mg冻存肝组织，充分碾磨裂解，4℃下14000 r/m离心20 min，收集上清液。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按Western blot操作流程进行检测，应用Image-J软件分析Bcl-2、Bax、Casp-9、BiP、CHOP和HSC70各条带灰度值。以HSC70作为内参，对各目的蛋白相对表达量进行分析。

2 结果

2.1 各组肝组织病理学表现 对照组肝细胞条索结构正常，少见炎性细胞，极少胶原纤维分布于汇管区周围，未见纤维沉积；模型组可见肝细胞排列紊乱，炎性细胞大量浸润，粗大纤维条索明显沉积，胶原纤维大量产生，形成纤维间隔围绕在汇管区和血管周围，假小叶形成；SST干预组多数肝细胞排列结构较为清晰，炎性细胞浸润较轻，但仍可见胶原纤维沉积，穿梭于汇管区和血管周围，程度较轻(图1)。

图1 各组小鼠肝组织病理学表现 (A：天狼猩红染色，100×；B：免疫组化染色，200×，黑色箭头所示为I型胶原纤维)

2.2 各组肝组织Ishak评分比较 与对照组比，模型组肝组织纤维化和炎性活动明显增高，胶原蛋白沉积显著(P<0.01)；SST干预组肝组织纤维化和炎性活动程度下降，显著低于模型组(P<0.05)，而两SST处理组间无显著差异(表1、表2)。

表1 各组小鼠肝组织炎症活动度Ishak评分比较

表2 各组小鼠肝纤维化沉积程度Ishak评分比较

2.3 各组血清肝酶水平比较 模型组血清AST和ALT水平显著高于对照组(P<0.01)；SST干预组血清AST和ALT水平显著低于模型组(P<0.05，表3)。

表3 各组小鼠血生化指标比较

2.4 各组肝组织凋亡相关蛋白表达比较 模型组促凋亡蛋白Bax和Casp-9相对表达量显著强于对照组(P<0.001)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2相对表达量显著弱于对照组(P<0.01)；SST干预组肝组织Bax和Casp-9蛋白相对表达量显著弱于模型组(P<0.05)，而Bcl-2蛋白相对表达量未见明显改变(图2)。

*** P<0.001，** P<0.01，* P<0.05

2.5 各组肝组织内质网应激相关蛋白表达比较 与对照组比，模型组BiP和CHOP蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；SST干预组肝组织BiP和CHOP蛋白表达水平较模型组显著下降(P<0.05，图3)。

*** P<0.001

3 讨论

肝纤维化是各种急慢性肝损伤导致的肝纤维化生成和炎症反应的过程[4-8]。如不及时处理可能进展成为肝硬化甚至肝癌。在肝纤维化进程中，多种肝内细胞被活化，伴随产生大量的炎症因子和趋化因子，如胶原蛋白、α平滑肌肌动蛋白、波形蛋白等纤维细胞相关蛋白的过表达，最终导致肝纤维化的发生。有研究表明，ECM的分泌和沉积会激发ERS。在轻度细胞炎症反应时，ERS可通过提高蛋白质代谢能力使细胞恢复正常状态[9-12]。当慢性持续性刺激存在时，ERS则通过促进细胞凋亡，进一步加速肝纤维化的进展。因此，通过减轻肝脏细胞炎症反应，抑制ERS过度激活，对减缓或逆转肝纤维化形成具有重要的意义[13-15]。

SST是一种广泛存在于胃肠道、脑、内外分泌腺等组织的环状多肽类激素[16-18]。研究证实，SST能够抑制免疫过度激活，减轻炎症反应，具有细胞保护作用。但其是否参与调节ERS，并进一步调控肝纤维化形成目前未见报道。

在本研究，我们首先建立了小鼠LF动物模型，病理学检查见CCl4可诱导胶原和纤维沉积，肝细胞排列结构紊乱，炎症细胞浸润明显。血清AST和ALT明显升高。肝组织Ishak评分显示肝脏炎症活动度和纤维化表现明显，说明CCl4成功诱导了LF的形成，并伴有严重肝脏炎症性改变。给予SST干预后，肝组织病理学改变明显减轻，肝功能和纤维化程度明显减轻，说明SST对肝脏炎症反应及其导致的肝纤维化程度有改善作用。

我们进一步探究了SST是否参与调解ERS。通过对凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Casp-9表达检测，发现CCl4能够导致促凋亡蛋白Bax和Casp-9表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。同时，ERS相关蛋白BiP和CHOP表达显著增加，说明CCl4激活ERS反应并导致细胞大量凋亡。给予SST干预后，肝组织Bax和Casp-9蛋白表达显著下降，BiP和CHOP蛋白水平明显降低，说明SST可以抑制纤维化小鼠肝组织ERS，减轻细胞凋亡程度[19,20]。

综上所述，本研究结果表明SST能够通过改善肝脏炎症状态，抑制ERS，从而减轻肝脏损伤，抑制细胞凋亡，最终达到改善LF的目的。本研究为LF的防治提供了新的理论依据，但ERS涉及的通路较多，关于SST具体影响哪条通路还有待进一步深入研究。