乳酸菌发酵枸杞饮料制作工艺优化的研究

2021-03-15

酿酒科技 2021年1期

(宁夏红枸杞产业有限公司，宁夏中宁 755100）

枸杞是药食同源的植物，是中草药的重要成分。具有较高的营养价值和生理保健功能，枸杞活性成分的研究是目前的热点之一[1]。枸杞多糖作为天然植物多糖，无论在临床应用还是保健类食品的开发方面都具有广阔的市场前景[2]。

随着经济、现代医学和食品科学的发展，人们越来越重视食品的营养保健作用，枸杞饮料作为一种功能性保健饮品越来越深受人们的喜爱[3-4]，并且随着发酵饮料行业的发展，将枸杞进行乳酸菌发酵，制成各类乳酸菌发酵饮料已经成为了一种全球性饮品，它的功能越来越被人们认识，产品也越来越被消费者接受[5]。

本试验首先对乳酸菌发酵枸杞时菌种接入量、混合菌种比例、发酵温度进行优化，选取风味最好、枸杞多糖保存率含量较高的原浆发酵工艺，再将发酵原浆进行调配，制成酸甜爽口，营养物质丰富的枸杞饮料，为枸杞饮料产品开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

材料：宁夏中宁枸杞，宁夏红枸杞产业有限公司提供；嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌，丹尼斯克公司提供。

试剂及耗材：白砂糖、柠檬酸、木聚糖酶、L-阿拉伯糖、稳定剂，均为市售食品级，乙醇、亚硫酸钠均为分析纯。

仪器设备：TU-1901 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，上海精密仪器厂；FA1004 精密电子天平，上海天平仪器厂；FW100 型万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵枸杞原浆工艺流程（图1）

图1 发酵枸杞原浆工艺流程

1.2.2 发酵条件试验测试指标与方法

乳酸菌接种量的确定：以发酵液pH4.01 时，作为枸杞发酵原浆的发酵终点，发酵温度为40 ℃，测定不同接种量4%、5%、6%、7%、8%条件下枸杞发酵原浆多糖保存率并进行风味评估。

发酵温度的确定：以发酵液pH4.01 时，作为枸杞发酵原浆的发酵终点，乳酸菌接种量为6 %，测定不同发酵温度38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃条件下枸杞发酵原浆多糖保存率并进行风味评估。

嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌混合比例的确定：以发酵液pH4.01 时，作为枸杞发酵原浆的发酵终点，乳酸菌接种量为6 %，发酵温度为42 ℃，测定嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌混合菌种不同比例1∶1、1∶2、1∶3，2∶1、3∶1 条件下枸杞发酵原浆多糖保存率并进行风味评估。

1.2.3 枸杞多糖及多糖保存率的测定

枸杞多糖的测定：取1 mL 样品加入到85%vol浓度的乙醇中沉淀2 h，8000 r/min离心5 min，弃上清留沉淀，用5 mL丙酮洗涤沉淀两次后，以8000 r/min离心5 min，弃上清留沉淀。用5 mL 乙醚洗涤沉淀，4000 r/min 离心10 min，弃上清液留沉淀，等沉淀挥发至干后溶解于10 mL 蒸馏水中待测。按参照文献[6]所述方法对枸杞多糖进行测定。

1.2.4 发酵枸杞饮料的制备工艺（图2）

1.2.5 发酵枸杞饮料单因素试验

图2 发酵枸杞饮料的制备工艺

发酵枸杞原浆添加量对发酵枸杞饮料口感的影响：取9%的白砂糖，0.3%阿拉伯糖，加RO 水至200 mL，用柠檬酸调pH3.7，测定5 %、7 %、9 %、11 %、13 %发酵枸杞原浆添加量对饮料口感的影响。

白砂糖的添加量对发酵枸杞饮料口感的影响：取9 %发酵枸杞原浆，0.3 %阿拉伯糖，加RO 水至200 mL，用柠檬酸调pH3.7，测定5 %、7 %、9 %、11%、13%白砂糖添加量对饮料口感的影响。

柠檬酸的添加量对发酵枸杞饮料口感的影响：取9 %发酵枸杞原浆，0.3 %阿拉伯糖，9 %的白砂糖，加RO 水至200 mL，用柠檬酸调节pH 值，测定pH值为3.3、3.5、3.7、3.9、4.1时饮料的口感。

根据以上单因素试验的优化结果，选取发酵枸杞原浆添加量（A）、白砂糖添加量（B），柠檬酸添加量（C）为影响因素，配制后饮料口感为响应值，每个因素取3 个水平，轴向点设为±1，进行Box-Behnken 试验设计。每个试验重复3 次，取其平均值，各试验因素水平见表1。

表1 试验因素水平

1.2.6 发酵枸杞饮料感官评定

以发酵枸杞饮料的滋味、口感、气味、色泽为评价指标，开展人工感官评定。分别邀请10 名男性和10 名女性人员，年龄阶段随机，身体健康，感官灵敏，并通过培训，评定前30 min 要洁口，饮食清淡，不抽烟，品尝每个样品前需使用纯净水漱口，最后得分取20 名评定人员的平均分数。感官评定标准见表2。

表2 发酵枸杞饮料感官评分表

1.2.7 发酵枸杞饮料成分测定

饮料中蛋白质的测定，参考国家标准GB 5009.5；饮料中脂肪的测定，参考国家标准GB 5009.6；饮料中碳水化合物的测定，按参考文献[7]中对饮料碳水化合物的测定；饮料中枸杞多糖的测定，参考材料与方法1.2.3。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌接种量的确定(图3)

由图3 可以看出，多糖的保存率随着乳酸菌接种量的逐渐增加而减小，这是因为乳酸菌将多糖类物质分解成乳酸，导致多糖含量降低。在乳酸菌接种量在4 %～7 %之间，多糖的保存率的下降趋势较为平缓，同时也可看出枸杞发酵原浆在乳酸菌接种量为6%时，其风味值达到了最高。为了保证风味值好，多糖保存率较高，最终选定乳酸菌的接种量为6%。

图3 乳酸菌接种量对枸杞多糖保存率和原浆风味的影响

2.2 发酵温度的确定(图4)

图4 发酵温度对枸杞多糖保存率和原浆风味的影响

由图4 可以看出，发酵温度对多糖保存率的影响并不是很显著，发酵温度在44 ℃时，多糖保存率达到最低，这可能是因为在温度为44 ℃时，混合菌的发酵效率最高，对多糖的分解也达到最高[8]。从图4 还可看出，在发酵温度为44 ℃时，枸杞发酵原浆拥有良好的风味，与42 ℃发酵条件下相比，其风味相差并不大。鉴于42 ℃下枸杞发酵原浆拥有较高的枸杞多糖保存率以及良好的感官评分，因此，选定发酵温度为42 ℃。

2.3 嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌混合比例的确定(图5)

由图5 可看出，枸杞多糖保存率在嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌混合比例1∶3 条件下最低，2∶1条件下最高，其他混合比例下多糖保存率都具有一定的差异性，造成这种现象的原因可能是不同乳酸菌对多糖的分解能力不同。在两种菌混合比例为2∶1时，其风味值也同时达到了最高，因此最终确定嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌混合比例为2∶1。

图5 嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌混合比例对枸杞多糖保存率和原浆风味的影响

2.4 发酵枸杞饮料单因素试验结果(图6、图7)

图6 枸杞发酵原浆、白砂糖添加量对枸杞饮料口味影响

图7 柠檬酸添加量对枸杞饮料口味影响

由图6、图7 可以看出，不同调配方式，其饮料的感官风味各不相同。选取各因素下饮料风味值最高的条件，初步确定发酵枸杞饮料的配制方案为：发酵枸杞原浆添加量大致为7 %，白砂糖添加量大致为9%，饮料pH值3.7。

2.5 响应面实验设计与结果分析

按照表1 用Box-Behnken 软件(V8.0.6) 设计的3因素3水平实验方案（表3）。

用Design-Expert 软件对表中数据进行多元回归拟合，得到发酵枸杞饮料感官评定（Y）相对于发酵枸杞原浆添加量（A）、白砂糖添加量（B），柠檬酸添加量（C）的多项回归方程为：

表3 响应面实验方案及结果

由表4的分析结果可以知，在一次项中，A对枸杞发酵饮料口感的影响极显著（P＜0.01）；B对枸杞发酵饮料口感的影响显著（P＜0.05）；C对枸杞发酵饮料口感的影响为极显著（P＜0.01）；AB、AC、BC这3对交互作用的分析中均为极显著（P＜0.01），由此可知，各个因素与响应值不仅是单纯的线性关系。在该实验设计范围内，R2＝0.9920，实验误差较小，模型为极显著（P＜0.0001），说明模型与实际实验拟合良好。

回归方程一次项回归系数绝对值大小依次为枸杞发酵原浆（A）、柠檬酸添加量（B）、白砂糖添加量（C）。整体模型的回归系数R2＝0.9641，说明模型响应发酵枸杞饮料感官评分变化95.36%来自所选因素变量。

2.6 两因素之间的交互作用

由以上得出的模型可以做出响应面图和等高线图(图8—图10)，各因素及其交互作用对响应值的影响可以通过组图直观表现出来。等高线图反映了交互作用的强弱[9-10]，通过分析等高线图可以得出每两个因素中对饮料口感影响较大的因素。

表4 枸杞发酵饮料感官评定回归模拟方差分析

图8 发酵枸杞原浆添加量、白砂糖添加量响应面及等高线

图9 发酵枸杞原浆添加量、柠檬酸添加量响应面及等高线

图10 柠檬酸添加量、白砂糖添加量响应面及等高线

从图8 可以看出，发酵枸杞原浆、白砂糖添加量的过高和过低都不利于发酵枸杞饮料口感的提升；发酵枸杞原浆添加量和白砂糖添加量等高线趋近椭圆，说明两者之间交互作用明显。从图9 可以看出，过高和过低的发酵枸杞原浆、柠檬酸添加量同样不利于发酵枸杞饮料口感的提升；发酵枸杞原浆添加量和柠檬酸添加量等高线趋近椭圆，说明两者之间交互作用明显；从图10 可以看出，白砂糖添加量对整体口感的影响并没有柠檬酸添加量所造成的影响大；两者的等高线趋近椭圆，说明两者之间同样有交互作用。

2.7 验证性实验

根据设计所得模型分析可得，枸杞发酵饮料调配方案为：发酵枸杞原浆添加量6.86 %，白砂糖添加量9.09 %，柠檬酸调节饮料pH3.65，发酵枸杞饮料感官评分可达到95.78 分。为验证响应面结果所得可靠性，根据实际操作，将发酵枸杞原浆添加量修正为6.8 %，白砂糖添加量9.1 %，柠檬酸调节饮料pH3.7；实际所得枸杞发酵饮料感官评分为95分，与模型相差0.81 %，说明模型与实际实验拟合良好。