人参石菖蒲醇提物对卵清蛋白联合烟熏法诱导咳嗽变异性哮喘模型大鼠的作用研究

律广富，朴永革，黄晓巍，李宝志，林 贺，李岳宸，李元实，马 超，庄雪峰，林 喆

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春130117；2.吉林烟草工业有限责任公司，长春130031；3.长春中医药大学药学院，长春130117）

咳嗽变异性哮喘（CVA），是一种特殊类型的哮喘，属于哮喘的一种，但也有认为其属于咳嗽的一种[1]，发病时间多集中在秋冬交接时间，但也存在全年发病病例。国医大师王烈教授认为本病发病机制及特点与哮喘相似，但与哮喘的喘息气促之症又不完全相同，因此将其命名为“哮咳”[2]。现代医学证明咳嗽变异性哮喘的发病机制较为复杂，多是内因外邪协同导致，为咳嗽变异性哮喘的治疗提供了新思路。中医认为风、痰、热、寒、淤是诱发咳嗽变异性哮喘的关键[3]。西医认为咳嗽变异性哮喘患者多表现为肺部炎症及免疫功能失调，导致肺脏功能失调，而发生慢性咳嗽[4]。

人参为我国传统中药，其性甘、温、平；味微苦；主要归脾、肺经、心经。现代医学证明，人参在抗氧化应激、抗炎等方面能够发挥作用[5]，在肿瘤抑制、神经系统、心血管等方面均证明有显著疗效[6]。由于人参主归肺经，又具有补气生津作用，现代研究证明人参在治疗支气管哮喘、小儿哮喘等肺部疾病方面疗效显著[7-9]。但在咳嗽变异哮喘治疗方面研究较少。石菖蒲化湿、开窍、豁痰，主要用于治疗痰迷心窍，驱湿热、湿温，在神经系统、心血管方面及肿瘤治疗均有一定报道[10]。因此本文将人参及石菖蒲联用，探究其对咳嗽变异性哮喘的作用，作为该疾病预防治疗的理论支持。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠，60只，体质量180～200g，购于长春市亿斯实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK（吉）-2018-0003。

1.2 药品与试剂

人参（吉林国安药业有限公司，20181101）；石菖蒲（吉林国安药业有限公司，20180201）；醋酸地塞米松片（遂成药业股份有限公司，H41021038，规格0.75mg/片）；卵清蛋白（Sigma，#SLBS6919）；氯化钠注射液（吉林省都邦药业股份有限公司，H22023069）；IL-4（批号：20200924）、IL-6（批号：20200924）、IFN-γ（批号：20200924）、IgE（批号：20200924）试剂盒（购自南京建成生物研究所有限公司）。

1.3 实验仪器

电子天平（福州华志仪器有限公司）；JA2003B电子分析天平（上海越平仪器公司）；JSC-202超声雾化器（辽宁鞍山电子医疗仪器厂）；粉碎机（北京中兴伟业仪器公司）；WP-UP-III-40精密型超体纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）；4℃低温离心机（Cerrtrifuge 5810R）；EYEL4 SLI-700恒温培养箱（上海爱朗仪器有限公司）；BC-5300Vet血细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗）；MultiskanFC型酶标仪（上海赛默飞世尔）。

2 实验方法

2.1 药物制备

人参石菖蒲提取物的制备：取人参与石菖蒲粉碎机粉碎，按2∶1混合，70%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇并浓缩至浸膏[11]，4℃冷藏保存待用。

2.2 分组及模型制备

分组：将60只健康雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、醋酸地塞米松组、人参石菖蒲高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只。

模型制备：模型及给药组大鼠每天在自制的烟熏仓内接受烟熏,每日2次,每次30min，烟熏2周后开始隔日腹腔注射10%卵清蛋白溶液1 mL3次，将大鼠置于自制的雾化箱给予5%卵清蛋白溶液雾化激发，每天1次，每次30 min，共激发3周，激发过程中继续烟熏，整个过程共持续6周[12]，空白对照组致敏时采用相同剂量生理盐水腹腔注射，激发时则采用相同剂量蒸馏水雾化激发。

2.3 给药

造模4周后开始灌胃给药，给药量为醋酸地塞米松（1mg/kg），人参石菖蒲高剂量组（16g/kg）、中剂量组（8g/kg）、低剂量组（4g/kg），空白组、模型组给予等量蒸馏水。

2.4 指标检测

2.4.1 大鼠引喘潜伏期:末次灌胃给药30min后，在雾化开始后，同时开始计时，记录大鼠出现明显喘息表现的时间，即为引喘潜伏期[13]。

2.4.2 样本采集：将大鼠麻醉后腹主动脉取血，取全血1 mL加入含有EDTA的抗凝管中待用，剩余血液4℃环境下3000r/min离心15min，分离血清，-20℃保存待用。去除颈部皮毛，钝性分离气管，剪开气管，注射器缓慢注入PBS缓冲液1ml，静置10s后，将缓冲液回抽，重复操作6次，以3500 r/min离心10 min，取上清液分装冻存于-20℃冰箱待用。

2.4.3 血液白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的检测：全自动血细胞分析仪分析全血中各细胞的数量。

2.4.4 大鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ测定：试剂盒检测血清中IL-4、IL-6、IFN-γ含量。

2.4.5 大鼠肺泡灌洗液IgE、IFN-γ测定：试剂盒说明检测肺泡灌洗液中IgE、IFN-γ含量。

2.5 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义即具有明显差异。

3 实验结果

3.1 人参石菖蒲提取物对咳嗽变异性哮喘大鼠引喘潜伏期的影响

与空白组比较，模型组大鼠引喘潜伏期明显降低（P＜0.01），与模型组相比，各给药组大鼠引喘潜伏期明显延长（P＜0.01）。结果见表1。

3.2 人参石菖蒲提取物对咳嗽变异性哮喘大鼠WBC、EOS、NEU的影响

与空白组相比，模型组大鼠血液WBC、EOS、NEU明显升高（P＜0.01），与模型组相比，醋酸地塞米松组、人参石菖蒲提取物高、中剂量组WBC、EOS、NEU明显降低（P＜0.01），人参石菖蒲提取物低剂量组WBC、EOS、NEU显著下降（P＜0.05），结果见表2。

表2 人参石菖蒲提取物对咳嗽变异性哮喘大鼠WBC、EOS、NEU的影响（n=10，±s）

注：与空白组比较，## P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量 WBC/（109/L）EOS/（109/L） NEU%空白组 - 7.51±0.56 0.56±0.21 35.7±3.22模型组 - 12.33±1.94## 1.52±0.41## 69.6±3.71##醋酸地塞米松组 1mg/kg 8.52±1.55**0.79±0.33**50.2±1.96**人参石菖蒲提取物高剂量组 16g/kg 8.83±1.72**0.85±0.32**51.5±2.41**人参石菖蒲提取物中剂量组 8g/kg 9.16±1.38**0.93±0.25**57.8±3.11**人参石菖蒲提取物低剂量组 4g/kg 10.09±1.51*1.09±0.39*60.8±4.57*

3.3 人参石菖蒲提取物对咳嗽变异性哮喘大鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ含量的影响

与空白组相比，模型组大鼠血清中IL-4、IL-6含量明显升高（P＜0.01）IFN-γ含量出现明显降低（P＜0.01），经给药后与模型组相比，各给药组大鼠血清IL-4、IL-6（P＜0.01）含量明显降低（P＜0.01），IFN-γ含量明显升高（P＜0.01），结果见表3。

表3 人参石菖蒲提取物对大鼠血清IL-4、IL-6、IFNγ含量的影响（n=10，x±s）

3.4 人参石菖蒲提取物对大鼠肺泡灌洗液IgE、IFNγ含量的影响

与空白组相比，模型组大鼠肺泡灌洗液中IgE含量明显升高，IFN-γ含量明显降低（P＜0.01）经给药后与模型组相比，各给药组大鼠肺泡灌洗液IgE含量明显降低（P＜0.01），IFN-γ含量明显升高（P＜0.01），结果见表4。

表4 人参石菖蒲提取物对大鼠肺泡灌洗液IgE、IFN-γ含量的影响（n=10，x±s）

4 讨论

据报道，咳嗽变异性哮喘在临床当中多数表现为咳嗽，而现阶段临床中多种肺部的疾病同样以咳嗽为主要特征，这就意味着在诊治咳嗽变异性哮喘与其他肺部疾病时会面临着较大的困难。在儿童时期如不接受恰当的治疗咳嗽变异性哮喘极易发展成哮喘，这就意味着在儿童时期接受正确的治疗对于阻止咳嗽变异性哮喘进一步发展具有十分重要的意义[14]。由于儿童对于西药的接受能力有限，具有更加温和疗效的中药逐渐受到重视。鉴于该疾病的药理学研究相对较少，本实验提供了中药防治咳嗽变异性哮喘新方向。

在探讨中药治疗的疗效及作用机制中，动物模型的选择至关重要。本实验采用卵清蛋白结合烟熏法复制模型[15-17]，方法可行性强。对于咳嗽变异性哮喘，现代医学诊断多集中在血常规、影像学检查、气道炎症等方面[18]。据报道人参、石菖蒲在炎症方面均具有一定的疗效[19-20]。故本实验采用卵清蛋白结合烟熏复制咳嗽变异性哮喘模型大鼠，通过观察大鼠引喘潜伏期、全血中白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的数量、血清中IL-4、IL-6、IFN-γ含量和肺泡灌洗液中IgE、IFN-γ含量变化，研究人参石菖蒲醇提物对于咳嗽变异性哮喘的治疗作用。

大鼠引喘潜伏期变化反映了咳嗽变异性哮喘主要特征咳嗽的严重程度，大鼠引喘潜伏期越长，证明大鼠咳嗽症状越轻，症状得到显著改善。由实验结果可知，人参石菖蒲醇提物可以显著提高大鼠的引喘潜伏期，减轻咳嗽症状。全血中白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞数量的变化，体现免疫功能的作用，IL-4、IL-6作为白介素家族的两种标志性白介素，反映咳嗽变异性哮喘大鼠的炎症水平，而IFN-γ具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调控的作用。实验结果表明，人参石菖蒲提取物高、中剂量组大鼠血清中WBC、EOS、NEU、IL-4、IL-6含量显著降低、IFN-γ含量显著升高、肺泡灌洗液中IgE含量显著降低、IFN-γ含量显著升高。表明人参石菖蒲提取物可以有效降低咳嗽变异性哮喘大鼠肺部及体内的炎症水平，缓解卵清蛋白结合烟熏所致的大鼠咳嗽变异性哮喘。