苯醚甲环唑与吡唑醚菌酯复配对石榴干腐病菌的联合毒力测定

李松远，姚 昕，涂 勇

（西昌学院农业科学学院，四川西昌 615013）

石榴是在我国有着长久种植历史的水果，在南北地区均有种植，有着极高的食用和药用价值[1]。石榴干腐病（Coniella granati）是石榴生长和贮藏期的一种常见病害，其病原菌一般在石榴花期结束至套袋前潜伏侵染，病果的典型特征是幼果在潮湿情况下变褐腐败，如果遇到高温干旱天气会使果实失水皱缩，出现裂果或者红褐色僵果[2]。即使是在果实成熟后的贮运过程中依旧会发病，引起大量烂果，对石榴产业危害极大。

石榴干腐病的防治药剂以多菌灵和甲基硫菌灵等苯并咪唑类杀菌剂为主[3-4]，但此类药剂引发的病菌抗药性问题已经引起了人们的高度重视。因此，如何在现有药剂基础上，筛选出更为有效并能一定程度上延缓病菌抗药性的药剂组合具有十分重要的意义。苯醚甲环唑（Difenoconazole）是一种新型的甾醇脱甲基化广谱杀菌剂，对许多病菌均有较好的抑制作用，在果树、蔬菜等作物中被广泛使用[5-6]。吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）是一种新型广谱甲氧基丙烯酸酣类杀菌剂，其机理是对病菌线粒体的呼吸作用产生抑制效果，从而阻止病菌细胞的生长发育致其死亡，该药剂兼具治疗、保护作用。目前，国内还未见苯醚甲环唑与吡唑醚菌酯复配对石榴干腐病菌的联合毒力测定方面的研究报道。

为充分利用以上两种药剂的优势，最大限度地降低病原菌对药剂的抗药性，本试验探索了苯醚甲环唑与吡唑醚菌酯复配后对石榴干腐病的室内联合毒力，以期为石榴干腐病的药剂防治提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试药剂：20%苯醚甲环唑水乳剂，青岛瀚生生物科技有限公司生产；30%吡唑醚菌酯悬浮剂，河南勇冠乔迪农业科技有限公司生产。

供试菌株：2020年11月从贮藏期发病石榴的果皮上运用组织分离法获得，通过培养性状观察和分子生物学手段并结合柯赫氏法则鉴定的石榴干腐病菌。

1.2 试验方法

1.2.1 不同复配组合对石榴干腐病菌菌丝的室内毒力测定

以药剂有效成分在含药平板培养基中的浓度作为菌体实际受药浓度。试验前在超净工作台上将苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯用无菌水稀释成6 000 mg·L-1的母液，再按不同的质量比（1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1、0∶1）配制出混合药液。之后再用无菌水将上述药剂制得质量浓度为1 500.0 mg·L-1、600.0 mg·L-1、300.0 mg·L-1、150.0 mg·L-1、30.0 mg·L-1和3.0 mg·L-1的药液备用。在PDA 培养基灭菌后冷却到55 ℃左右时，用移液管分别移取1.0 mL的上述混合药液加入49 mL PDA 培养基中后迅速摇匀，以制取出30 mg·L-1、12 mg·L-1、6.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1、0.6 mg·L-1和0.06 mg·L-1的含药平板培养基。各组浓度的药剂分别设置3 个重复组和一个空白对照组，空白对照组用等量的无菌水替代药剂。

使用酒精灯灼烧冷却后的打孔器在纯化后的菌落边缘处打取菌饼（直径0.4 cm）后接种在含药平板培养基的正中央，置于湿度60%、温度26 ℃的恒温培养箱中培养，于第6 d 使用游标卡尺测量各个供试平板培养基上的菌落直径，每处理以3 次重复测量值平均数为最终数据。

1.2.2 数据处理

通过Microsoft Excel 和SPSS 软件进行数据处理，采用Wadley 法[7]进行联合毒力评价。分别以参试药剂及其不同配比组合的各浓度梯度对数作为自变量x，把其对应的相对抑菌率的查表几率值作为因变量y，运用最小二乘法分别解出毒力回归方程（y=a+bx），用相关系数（r）进行方程显著性检验，最终计算出各单剂和混合药剂的EC50和EC90，主要计算公式如下：

菌落的净生长量=菌落直径-菌饼直径；

相对抑菌率=[(对照组菌落的净生长量-处理组菌落的净生长量)/对照组菌落的净生长量]×100%；

公式中，复配药剂之一的苯醚甲环唑用A 代表，其配比用a 表示；另一药剂吡唑醚菌酯则用B 代表，其配比则用b 表示；各混剂的实际观察值用ob 表示，由各配比计算得到的理论值则用th 表示。最终评价标准为：SR＞1.5，增效作用；0.5≤SR≤1.5，相加作用；SC＜0.5，拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 单剂及复配组合对石榴干腐病菌菌丝抑菌率比较

苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯单剂及其复配组合对石榴干腐病菌菌丝抑菌率比较结果见表1、表2、表3。

由表1 可以看出，苯醚甲环唑和吡唑嘧菌酯在0.06～30.0 mg·L-1浓度处理下，二者对石榴干腐病菌的抑菌率差异显著（P＜0.05），且其抑菌效果随着供试药剂浓度的增加而提升；相同浓度下，苯醚甲环唑的抑菌效果均略高于吡唑醚菌酯。

表1 苯醚甲环唑、吡唑嘧菌酯单剂对石榴干腐病菌的抑菌率

由表2 表明在供试药剂作用浓度范围内，无论何种混配比例，不同浓度对石榴干腐病菌的抑菌率在P＜0.05水平上均差异显著，且随着浓度增大，抑菌率呈上升的趋势。在同一浓度处理下，不同配比组合间抑菌率也存在一定差异，以2∶1的组合平均抑菌率最大。

表2 苯醚甲环唑与吡唑嘧菌酯不同混配组合对石榴干腐病菌的抑菌率

由表3 数据可以得知，同一浓度水平下，在3.0～30.0 mg·L-1范围内，两种药剂的单剂与混剂的最大抑菌率和最小抑菌率之间均存在显著差异（P＜0.05），混剂无论是最大抑菌率还是最小抑菌率均大于单剂；在0.06 mg·L-1和0.60 mg·L-1浓度水平下，单剂的抑菌率均介于混剂的最大抑菌率和最小抑菌率之间，差异达到了显著水平（P＜0.05）。

表3 苯醚甲环唑、吡唑嘧菌酯单剂及其混剂间同一浓度下的抑菌率比较

2.2 混剂对石榴干腐病菌的联合毒力作用

苯醚甲环唑与吡唑醚菌酯不同配比的混合物对石榴干腐病菌菌丝生长均表现出较强的抑制作用（见表4）。7个混合配方的增效作用明显，其SR 值分别为3.68、8.38、6.16、5.31、9.33、4.64、4.32，均远高于参考标准值1.5。表明这两种药剂复配对石榴干腐病菌的控制作用更强，其中苯醚甲环唑与吡唑醚菌酯的质量配比为2∶1 时的增效作用最显著，其增效系数高达9.33，该配比下的EC50观察值和EC90值均为最低，仅为1.25 mg·L-1和4.03 mg·L-1。此外，两种供试单剂之间比较，苯醚甲环唑对该菌的抑制效果较强，其EC50观察值、EC90值均处于较低水平，分别为10.21 mg·L-1、70.15 mg·L-1。

表4 苯醚甲环唑与吡唑醚菌酯复配对石榴干腐病菌菌丝的联合毒力

3 小结与讨论

苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯是两种重要的优秀杀菌剂，两种药剂的合理复配既能发挥较强的增效作用[8-9]，更可延缓病菌对其产生抗药性，增加其在生产中的使用范围和时间。

本试验结果表明，苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯单剂对石榴干腐病菌菌丝生长均有显著抑制效果，其EC50分别为10.21 mg·L-1和16.48 mg·L-1；同一浓度下，苯醚甲环唑的抑菌率相对较强。按质量比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1 和4∶1 的7 个混配组合均表现出了明显的增效作用，其中以2∶1的组合增效作用最强，增效系数（SR）为9.33，与王丽等[2]的研究基本一致。此外，鲁海菊等筛选出甲霜灵·锰锌、百菌清和扑海因3 种药剂，均对石榴干腐病菌有较好的抑制效果[10]。除组合比例外，复配药剂的实际应用效果还受到制剂的理化稳定性、成本、用药习惯及应用对象品种、生长贮运环境等因素影响，因此还需进一步在生产中予以验证。