异烟酸-巴比妥酸分光光度法测定土壤氰化物和总氰化物方法研究

冯思敏，孙 文，孙绪博

（陕西地建土地工程技术研究院有限责任公司/陕西省土地工程建设集团有限责任公司/自然资源部退化及未利用土地整治工程重点实验室/陕西地建土地工程质量检测有限责任公司，陕西西安 710075）

氰化物是含氰基的一类化合物的总称，属于剧毒物质[1]，在酸性条件下具有挥发性，对人体的危害不可估量[2]。氰化物天然存在于2 000 多种植物中，其中有些是食用植物，例如木薯、杏、梨、李子、樱桃、桃等的种子和果核中[3-4]；作为基本原材料广泛应用于电镀、冶炼、焦化等化工生产中[5]，产生的工业废水进一步对土壤产生污染。土壤乃民之根本，大力推进净土工程，保障农用地和建设用地土壤环境安全属于重中之重的工作，检测土壤中的氰化物对于饮食安全、保护环境具有十分重要的意义[6]。

目前，实验室常用的测定氰化物的方法有硝酸盐容量法、离子色谱法、异烟酸-吡唑啉酮分光光度法、异烟酸-巴比妥酸分光光度法，这几种方法共同点都是土壤样品在特定介质中经加热蒸馏得到氰化氢，进一步进行反应得到氰化物和总氰化物的含量。硝酸盐容量法虽操作简单，但传统滴定法滴定终点不好判断，存在个体差异性，造成检测结果误差较大；离子色谱法需购置特定的检测器；分光光度法操作简单、成本低、测量结果稳定，分为异烟酸-吡唑啉酮分光光度法和异烟酸-巴比妥酸分光光度法[7-8]，前者显色温度高，需要水浴加热中显色40 min，且检出限高于后者，因此本文探讨选用异烟酸-巴比妥酸分光光度法作为实验室检测土壤氰化物和总氰化物的可行性。

1 方法原理

1.1 氰化物测定原理

碱金属、碱土金属的氰化物及锌氰络合物等氰化物在pH=4 的酒石酸介质中，二价锌存在下，经加热蒸馏能形成氰化氢，该试样中的氰离子在弱酸性条件下与氯胺T 反应生成氯化氰，与异烟酸作用，经水解反应生成戊烯二醛，再与巴比妥酸反应生成在600 nm波长有最大吸收的紫蓝色化合物。

1.2 总氰化物测定原理

简单氰化物（碱金属、碱土金属的氰化物及铵的氰化物）和绝大部分络合氰化物在磷酸介质中，二价锡和二价铜作用下，加热蒸馏能形成氰化氢，采用“1.1”所示的异烟酸-巴比妥酸分光光度法测定氰离子的含量，即异烟酸-巴比妥酸分光光度法测定土壤总氰化物的含量。

2 实验

2.1 仪器与试剂

主要仪器：分光光度计，一体化万用蒸馏仪，百分之一天平。

主要试剂：异烟酸、氢氧化钠、巴比妥酸、磷酸二氢钾、氯胺T、硝酸锌、酒石酸、氯化亚锡、硫酸铜、磷酸、铁氰化钾。

标准物质：水中氰成分分析标准物质（GBW(E)080115）。

2.2 样品的保存

土壤样品采集后用可密封的聚乙烯或玻璃容器在4 ℃左右冷藏保存，样品要充满容器，并在采集后48 h内完成测试分析。

2.3 样品的前处理

2.3.1 氰化物试样制备

称取约10 g干重的样品，用称量纸略微裹紧后移入蒸馏瓶。连接一体化万用蒸馏仪，打开冷凝系统，在100 mL 比色管中加入10 mL 氢氧化钠溶液（10 g·L-1）作为吸收液。在加入试样后的蒸馏瓶中依次加200 mL水、3.0 mL 氢氧化钠溶液（100 g·L-1）和10 mL 硝酸锌溶液（100 g·L-1），摇匀，迅速加入5.0 mL 酒石酸溶液（150 g·L-1），立即盖塞。打开一体化万用蒸馏仪，设置实验类别、加热功率、重量控制等各项参数，进行反应，当接收瓶内试样近100 mL时，停止蒸馏，用少量水冲洗馏出液导管后取出接收瓶，用水定容（V1），此为试样A。

另称取样品进行土壤干物质的测定。

2.3.2 总氰化物试样制备

称取约10 g干重的样品，用称量纸略微裹紧后移入蒸馏瓶。连接一体化万用蒸馏仪，打开冷凝系统，在100 mL 比色管中加入10 mL 氢氧化钠溶液（10 g·L-1）作为吸收液。在加入试样后的蒸馏瓶中依次加200 mL水、3.0 mL 氢氧化钠溶液（100 g·L-1）、3.0 mL 氯化亚锡溶液（50 g·L-1）和10 mL 硫酸铜溶液（200 g·L-1），摇匀，迅速加入10 mL 磷酸（2.69 g·mL-1），立即盖塞。打开一体化万用蒸馏仪，设置实验类别、加热功率、重量控制等各项参数，开始加热，当接收瓶内试样近100 mL时，用少量水冲洗馏出液导管后取出接收瓶，用水定容（V1），此为试样A。

另称取样品进行土壤干物质的测定。

2.3.3 空白试样制备

蒸馏瓶中只加200 mL 水和3.0 mL 氢氧化钠溶液（100 g·L-1），按步骤“2.3.1”或“2.3.2”操作，得到空白实验试样B。

2.4 样品的测定

从试样A、B 中吸取10.0 mL 于25 mL 具塞比色管中，向各管中加入5.0 mL 磷酸二氢钾溶液（pH=4），混匀，迅速加入0.30 mL 氯胺T（10 g·L-1）溶液，立即盖塞，混匀，放置1～2 min。向各管中加入6.0 mL异烟酸-巴比妥酸显色剂，显色。提前打开分光光度计预热15 min，设置测量方法，包括吸收波长、样品数目等参数，在600 nm 波长下，用10 mm 比色皿，以水为参比，测定吸光度。

3 分析与讨论

3.1 操作要点探索

3.1.1 显色条件的选择

根据方法反应原理，氰离子在弱酸性条件下与氯胺T 反应生成氯化氰，与异烟酸和巴比妥酸的共同作用，生成在600 nm 波长有最大吸收的紫蓝色络合物，考虑到一般常规实验室都并非严格控温的恒温实验室，因此需要考察显色温度和显色时间对反应的显色效果影响情况。选取标准序列中含量为2 μg 的氰化物标准溶液进行实验，考察了温度依次为15、20、25、30 ℃，显色时间依次为5、10、15、20、25、30 min时，分别测量样品的吸光度，对比反应的显色结果。

由图1 可见，当温度为15 ℃时，显色时间30 min吸光度达到最大，即显色效果最佳；当温度为20 ℃时，显色时间25 min显色效果最佳；当温度为25 ℃时，显色时间15 min显色效果最佳；当温度为30 ℃时，显色时间10 min 显色效果最佳。当显色效果达到最佳时，延长时间，吸光度基本不变。因此室温在15～30 ℃区间，温度越高显色时间越短，反应越高效。

图1 温度和时间对显色效果的影响

3.1.2 加热功率的影响

在加热蒸馏过程中通过一体化万用蒸馏仪加热单元的高温来实现土壤氰化氢和浸出液基质的分离，蒸馏仪每个单元的加热功率会决定加热装置的加热温度，进而影响氰化氢的蒸馏效果。对土壤样品进行加标回收试验，在10.0 g 干重的土壤样品中分别加入4.0 μg 氰化物和总氰化物，考察了加热功率在100、200、300、400、500、600 W时的前处理结果。

由图2 可见，当加热功率由100 W 升至300 W 时，土壤样品溜出液的氰化物和总氰化物回收率持续增加并达到最高；继续升高加热功率由300 W 升至600 W，土壤样品溜出液的氰化物和总氰化物回收率略微下降。因此，选择加热功率为300 W。

图2 加热功率对氰化物和总氰化物回收率的影响

3.2 线性范围

于6 支25 mL 具塞比色管中分别加入氰化钾标准使用溶液（0.500 μg·mL-1）0.00、0.10、0.50、2.50、4.00 和10.00 mL，再用氢氧化钠溶液（10 g·L-1）定容至10 mL。标准系列中氰离子的含量分别为0.00、0.05、0.25、0.75、3.00、5.00 g。向各管中加入5.0 mL磷酸二氢钾溶液（pH=4），混匀，迅速加入0.30 mL氯胺T（10 g·L-1）溶液，立即盖塞，混匀，放置1～2 min。向各管中加入6.0 mL 异烟酸-巴比妥酸显色剂，加水稀释至标线，摇匀，于室温下显色。提前打开分光光度计预热15 min，设置各项参数，以水为参比，测定吸光度。以氰离子的含量（μg）为横坐标，以扣除试剂空白后的吸光度为纵坐标，绘制校准曲线。

结果表明，采用异烟酸-巴比妥酸分光光度法测定土壤氰化物和总氰化物，标准系列中氰离子的含量分别为0.00、0.05、0.25、0.75、3.00、3.50、5.00 μg，线性方程为y=0.140 3x-0.000 7，相关系数为0.999 9。满足《土壤氰化物和总氰化物的测定分光光度法HJ 745-2015》（校准曲线回归方程的相关系数γ≥0.999）的要求。

3.3 方法检出限、测定下限的测定

根据《环境监测分析方法标准制修订技术导则》（HJ 168-2010）相关规定，按照样品分析的全部步骤进行，对浓度为0.05 mg·kg-1的氰化物和总氰化物样品进行7 次平行测定，计算7 次平行测定的标准偏差，按（1）式计算方法检出限，数据汇总于表1。

（1）式中，MDL 为方法检出限，t指“自由度为n-1、置信度为99%的t分布（单侧）”，S为n次平行测定的标准偏差。

由表1 可见，当测试土壤样品量为10 g，以异烟酸-巴比妥酸分光光度法测定氰化物、总氰化物的检出限分别为0.007、0.008 mg·kg-1，测定下限分别为0.028、0.032 mg·kg-1。满足《土壤氰化物和总氰化物的测定分光光度法HJ 745-2015》（当样品量为10 g，异烟酸-巴比妥酸分光光度法的检出限为0.01 mg·kg-1）的要求。

表1 氰化物和总氰化物方法检出限、测定下限测试数据

3.4 方法精密度的测定

分别对3 个含量水平同类型土壤样品的氰化物和总氰化物，按照样品分析的全部步骤进行测定，经加热蒸馏、分取、显色、上机测定，每个样品平行测定6 次，并分别计算不同样品的平均值、标准偏差、相对标准偏差等各项参数，数据汇总于表2。

表2 氰化物和总氰化物精密度测试数据

由表2 可见，对于氰化物含量水平为0.165、0.184、2.48 mg·kg-1实际土壤样品进行土壤氰化物测试，按照样品分析的全过程分别平行测定6 次，相对标准偏差分别为5.9%、4.2%、3.6%，满足《土壤氰化物和总氰化物的测定分光光度法HJ 745-2015》中精密度（实验室内相对标准偏差分别为3.9%～16%、3.7%～12%、0.6%～8.1%）的要求。

对于总氰化物含量水平为0.187、0.413、23.0 mg·kg-1加标实验分别测定6 次，总氰化物的相对标准偏差分别为12%、8.2%、3.9%，满足《土壤氰化物和总氰化物的测定分光光度法HJ 745-2015》中精密度（相对标准偏差分别为2.2%～20%、3.5%～12%、2.2%～9.5%）的要求。

3.5 方法准确度的测定

通过加标实验验证方法的准确度。分别对2 个含量水平实际土壤样品的氰化物和总氰化物，按照样品10 g干重土壤样品分析的全部步骤进行加标分析测定，每个样品平行测定6 次，并分别计算氰化物和总氰化物加标实验含量的平均值、加标量、加标回收率等各项参数，数据汇总于表3。

表3 氰化物和总氰化物加标回收实验测试数据

由表3可见，经过对氰化物含量为0.17、0.18 mg·kg-1的实际样品进行加标分析测定，加标量为4.0 μg，氰化物的回收率为90.3%、94.7%，满足《土壤氰化物和总氰化物的测定分光光度法HJ 745-2015》中准确度（加标回收率最终值为87.7%±16.6%、85.4%±18.8%）的要求。经过对总氰化物含量为0.19、0.41 mg·kg-1的实际样品进行加标分析测定，加标量为8.0 μg，氰化物的回收率为105.0%、94.2%，满足《土壤氰化物和总氰化物的测定分光光度法HJ 745-2015》中准确度（加标回收率最终值为93.6%±29.8%、96.2%±22.4%）的要求。

4 结论

本文通过对异烟酸-巴比妥酸的显色条件、一体化蒸馏仪的加热功率的探索，确定了最佳的反应条件，在此基础上经过对异烟酸-巴比妥酸分光光度法测定氰化物和总氰化物进行方法验证，表明线性关系、检出限、精密度、准确度均满足《土壤氰化物和总氰化物的测定分光光度法HJ 745-2015》的要求。因此，本方法适合用于大批量测定土壤氰化物和总氰化物。