不同颜色红三叶种子活力的初步研究

吕鹏辉, 张震东, 王晔, 周吉红, 宋振伟, 段留生, 李润枝*

(1.北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室, 植物生产国家级实验教学示范中心, 北京 102206; 2.北京市农业技术推广站，北京 100029; 3.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)

红三叶(TrifoliumpretenseL.)又叫红车轴草、红荷兰翘摇，属于豆科(Leguminosae)车轴草属(TrifoliumL.)，多年生草本，是车轴草属的最重要物种之一[1]。红三叶植株具有丰富的营养价值，且生长迅速，有固氮改良土壤的作用，是最重要的栽培豆科牧草之一，普遍用作绿地植物、水土保持植物、药用植物和优质牧草[2]。

种子活力是指在田间广泛条件下，种子迅速整齐出苗和长成正常幼苗潜力的总称[3]。高活力种子出苗率高、耐贮性强、幼苗健壮整齐、抗逆性强、生物产量高，而低活力种子易造成减产。在种子发育过程中，随着种子的成熟，种皮呈现不同的颜色，即种子的颜色可以反映出种子成熟度的差异[4]。孙德利等[5]研究发现，不同成熟度的苦瓜种子与果实、假种皮颜色变化密切联系，在生产上可将瓜皮颜色、假种皮颜色作为种子成熟度的估测指标。同时，很多研究显示，种子成熟度与种子活力密切相关。张晓洁等[6]测定了黑褐色、黄褐色、红色、白色4种不同成熟度棉花种子的活力，结果显示黑褐色和黄褐色种子的发芽率较高；常晖等[7]研究表明，黄芪种子种皮颜色越深、种子越大，种子活力就越高；李贺勤等[8]依据种子大小和颜色对甘蓝种子进行分级加工，结果表明种子大小和颜色分级能有效提高甘蓝种子质量，且存在种皮颜色越深种子活力就越高的变化趋势。

目前，我国在红三叶生产利用中还存在很多问题，如持久性较弱、再生性差、抗旱抗寒性差、成熟种子易脱落、不可机械收割等[9]。特别是红三叶在生长过程中由于开花期较长，收获时同一植株上种子成熟度不一致，种皮呈现黄色、黄绿色、黄褐色、黄紫色等不同颜色，同一种批中种子活力参差不齐，导致种子质量不高，是生产中比较突出的问题[10]。张元科[11]对蒙农1号红三叶种子特征的研究表明，红三叶种子颜色存在多种类型，其中黄色种子出现频率最大，种子整体颜色在黄色和黄褐色之间。但是对于不同颜色红三叶种子的活力研究，尚未见报道。因此，本研究以同一红三叶种批中不同颜色种子为材料，通过常温发芽试验、低温发芽试验、干旱发芽试验及种子生理指标测定，研究不同颜色种子的活力差异，明确种子成熟度与种子活力的关系，为红三叶种子的清选加工和适期收获提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用红三叶种子为试验材料，将同一批次种子按照颜色分为黄色种子(yellow seed,YS)、黄褐色种子(yellow-brown seed,HS)和褐色种子(brown seed,RS)，与三种颜色的混色种子(mix-color seed,MS)一同进行试验(图1)。所用种子来自淘宝北槿园艺官方店。

图1 不同颜色的红三叶种子

1.2 试验设计与方法

1.2.1种子萌发试验 为了更加全面评价不同颜色红三叶种子的种子活力情况，设置常温发芽、低温发芽和干旱发芽3个种子萌发试验。根据预试验的结果设置种子发芽试验的观察时间为10 d。因而，常温发芽试验的条件设置为20 ℃培养10 d；低温发芽试验条件设置为4 ℃培养10 d，后转入20 ℃培养10 d；干旱发芽试验为用10%PEG-6000溶液作为培养试剂，其他同常温发芽试验。用1%次氯酸钠溶液对红三叶种子消毒10 min，用蒸馏水反复冲洗3遍。在发芽盒(12 cm×12 cm×6 cm)中放置两层滤纸，用去离子水润湿，将消毒的红三叶种子随机选取100粒，摆放到发芽盒中，3次重复。放置到相应萌发条件，每天记录发芽种子数，发芽结束后测定各项发芽指标。发芽试验均在PRX-6WB光照培养箱(宁波赛福实验仪器有限公司)中进行，24 h光照，光强8 000 lx。

发芽势(germination energy，GE)、发芽率(germination percentage，GP)、发芽指数(germination index，GI)和平均发芽天数(mean germination time，MGT)按照以下公式进行计算。

GE=规定天数发芽数/种子总粒数×100%

(1)

GP=末次计数发芽数/种子总粒数×100%

(2)

GI=∑(Gt/Dt)

(3)

MGT=∑(Gt×Dt)/∑Gt

(4)

式中，规定天数取4 d,Dt指第t天，Gt指Dt相对应的发芽种子数。

1.2.2种子电导率测定 随机选取100粒种子，用JA2003天平[邦西仪器科技(上海)有限公司]称重后将种子放入装有50 mL水的烧杯中，薄膜覆盖后放入25 ℃培养箱培养24 h，用DDS-307A电导率仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)测定电导率[12]，3次重复。

电导率(μS·cm-1·g-1)=样品值/样品种子重量

(5)

1.2.3种子OD值测定 将种子放入烧杯，加入50 mL去离子水，放入25 ℃培养箱培养24 h，以纯水作为对照，分别浸种4、8、12、24 h时，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计(上海析谱仪器有限公司)测定286 nm吸收波长的光密度[13]，3次重复。

1.3 种子活力的综合评价

用模糊数学隶属法[14]对4种颜色红三叶种子进行综合评价，在计算隶属值时，先将数据标准化处理，然后计算每个指标的隶属函数值[u(Xj)]、标准差系数(Vj)、权重系数(Wj)和综合隶属函数值(D)。

u(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(6)

u(Xj)=(Xmax-Xj)/(Xmax-Xmin)

(7)

(8)

(9)

(10)

若指标与种子活力呈正相关，用公式(5)进行计算，否则用公式(6)进行计算。D值越大，种子活力越高；D值越小，种子活力越低。

1.4 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2010对所测定的数据进行初步整理，然后再用SPSS 23.0对数据进行统计分析。选择LSD差异法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同颜色红三叶的种子萌发指标

由表1可知，在常温发芽试验中，红三叶黄色种子的发芽势、发芽率和发芽指数显著高于其他3种颜色的种子(P<0.05)，分别为79%、89%和32.0，而黄褐色种子的发芽势、发芽率和发芽指数显著低于其他3种颜色的种子(P<0.05)。黄色种子、黄褐色种子、褐色种子、混色种子的平均发芽天数分别为3.1、3.9、3.4和3.4 d，其中黄褐色种子的平均发芽天数显著高于其他3种颜色的种子(P<0.05)。在低温发芽试验中，黄色和褐色种子的发芽势、发芽率和发芽指数无显著差异，均较大，且显著高于黄褐色种子的相应指标(P<0.05)。黄褐色种子的发芽势、发芽率、发芽指数显著低于其他3种颜色的种子(P<0.05)。黄色种子的平均发芽天数显著低于混色种子，与黄褐色和褐色种子差异不显著。在干旱发芽试验中，黄色种子的发芽势、发芽率和发芽指数最高且显著高于其他3种颜色种子，而黄褐色种子的发芽势、发芽率和发芽指数显著低于其他3种颜色种子(P<0.05)。黄色种子的发芽天数最少，但是与褐色和混色种子差异不显著，而黄褐色种子的发芽天数显著高于其他3种颜色种子(P<0.05)。综上可知，在常温发芽、低温发芽和干旱发芽试验中，黄色种子的发芽能力均显著高于其他3种颜色种子，种子活力最高。

表1 不同颜色红三叶的种子萌发指标

2.2 不同颜色红三叶种子萌发指标的相关性分析

种子活力可以通过不同条件的萌发试验来进行评价，而不同萌发指标是否存在相关性是综合评价的基础。由表2可知，常温发芽的发芽势与干旱发芽的发芽势呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数为0.999，与干旱发芽的发芽率和发芽指数呈显著正相关(P<0.05)，相关系数分别为0.970和0.983；常温发芽的发芽率与干旱发芽的发芽率和发芽指数呈极显著正相关(P<0.01)，相关系数分别为0.998和0.999；常温发芽的发芽率与低温发芽的发芽率、发芽势和发芽指数以及干旱发芽势呈显著正相关(P<0.05)；常温发芽的发芽指数与干旱发芽的发芽率呈显著正相关(P<0.05)；常温发芽的发芽天数与干旱发芽的发芽势呈极显著负相关(P<0.01)，与干旱发芽的发芽率和发芽指数呈显著负相关(P<0.05)，相关系数分别为-0.997、-0.961、-0.975。由此可见，各萌发指标间存在不同程度的相关性，因此通过综合鉴定可以降低误差，提高活力评价的准确性。

表2 不同颜色红三叶种子萌发指标的相关性分析

2.3 不同颜色红三叶种子浸出液的OD值和电导率

紫外分光光度计测定红三叶种子浸泡4、8、12、24 h的OD值，结果见表3，可见，随着浸泡时间的延长，种子浸出液的OD值不断增加，在24 h时达到最大值。为了进一步确定浸出液OD值和发芽率之间的关系，对种子浸出液OD值和常温发芽率进行回归分析，得到回归方程，分别为y=-0.101 8x+0.339 3，R2=0.672 5(浸泡4 h)；y=-0.113 2x+0.443 3，R2=0.385 9(浸泡8 h)；y=-0.332 4x+0.726 0，R2=0.845 1(浸泡12 h)；y=-0.611 0x+1.095 9，R2=0.929 1(浸泡24 h)。由回归方程得出，不同浸泡时间的浸出液OD值与红三叶种子萌发率存在负相关关系，即浸出液OD值越低，种子发芽率越高。其中浸泡24 h的浸出液的OD值与发芽率的相关系数最高，R2=0.929 1，说明在本研究条件下，红三叶种子浸泡24 h时浸出液的OD值能较好地反映红三叶种子的活力。

表3 不同颜色红三叶种子的电导率和OD值

不同颜色红三叶种子浸泡24 h后，黄褐色种子的OD值最高，为0.80；黄色种子的最低，为0.53，且二者差异显著。黄褐色种子的电导率也最高的，为428.2，且显著高于其他颜色种子；黄色、褐色和混色种子的电导率差异不显著。因此，本研究结果说明黄褐色种子的活力最低。

2.4 不同颜色红三叶种子活力的综合评价

隶属函数分析结果(表4)显示，黄色种子的D值最大，为0.913，黄褐色种子的D值最小，为0.002，表明黄色种子的活力最高，黄褐色种子的活力最低。4种不同颜色红三叶种子的活力顺序依次为：黄色种子>褐色种子>混色种子>黄褐色种子。

表4 不同颜色红三叶种子检测指标的综合评价分析

3 讨论

种子劣变和生理紊乱引起的细胞膜完整性变化是造成种子活力差异的关键因素，种子活力越高，种子浸出液的OD值和电导率越低[15]。鲁黎明等[13]研究表明, 在25 ℃条件下, 烟草种子经过24 h浸泡后, 种子浸出液的紫外吸光值能够在较大程度上反映烟草种子的活力，且与之呈负相关关系。Dias等[16]研究发现，大豆种子浸泡8和12 h的电导率可以用于检测大部分种子活力的差异，16、20和24 h浸泡液的电导率则可以用于检测种子活力差异小的种子批。本研究发现，红三叶种子浸泡24 h后的电导率能较好地反映种子活力。Mavi等[17]研究发现，9个不同品种萝卜种子的标准发芽率与电导率值呈显著负相关关系，与本研究结果一致。

随着种子成熟度逐步提高，种子的种皮颜色也越来越深，生长在母株不同部位的种子由于其接收的营养和成熟期的不同，收获时同一种批中也存在不同颜色的种子，其活力之间也有差异。王广印等[18]将同一蕹菜种批按照种子颜色分为三级，然后测定其种子活力，发现不同颜色种子的活力存在极显著差异，种子颜色越深其活力越高。李锡香和胡淼[19]研究表明，深褐色红菜苔种子的发芽势、简化活力指数、发芽率均显著高于深白色和灰褐色种子。董青松等[20]在广金钱草种子颜色与发芽率相关性研究中表明，黄色种子的发芽率显著高于其他颜色，同时在储藏过程中，随着种皮颜色的变浅，种子活力也随之降低。由于红三叶的开花期不一致，收获时同一种批包含不同种子成熟度的颜色各异的种子。本研究通过常温、低温和干旱发芽试验比较同一红三叶种子批中不同颜色种子的萌发指标，结果表明，红三叶黄色种子的发芽率、发芽势和发芽指数明显高于其他颜色，而发芽天数小于其他颜色种子，同时黄色种子浸出液的电导率和OD值也最低。黄褐色种子的发芽率、发芽势和发芽指数明显低于其他颜色，而发芽天数大于其他颜色种子。说明不同颜色红三叶种子的活力存在差异，即种子成熟度与种子活力密切相关，这与上述其他植物的研究结果一致。通过模糊隶属函数法综合评价4种不同颜色的红三叶种子活力，结果排序为黄色种子>褐色种子>混色种子>黄褐色种子，本研究结果为红三叶种子的清选加工和适期收获提供了理论参考。