常见化疗药物对免疫酶促反应的干扰效应

张助，毛朝明，蒋茜，丁超，刘佳梦，康萍

(江苏大学附属医院核医学科，江苏 镇江 212001)

酶免疫技术是一种最常见的标记免疫技术，过去的30多年，标记免疫测定技术广泛用于各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物、激素、病毒抗原抗体等检测。然而，该技术是借助了免疫反应的特异性和标记技术的高灵敏性，对被检测物的测定仍是非直接测定，反应体系易受标本源性干扰物的影响[1]，其中，药物干扰是常见因素之一。据研究显示，影响实验室检测结果的药物达万种[2]，化疗药物对免疫分析的干扰也时有报道[3-4]。为了更好地了解化疗药物是否干扰酶免疫分析，本研究选取17种不同类型常见化疗药物，对两种酶反应体系的干扰情况进行分析。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

ELISA试剂盒来自英科新创(厦门)科技有限公司；化学发光测定试剂(美国Beckman Coulter公司)。本研究所用化疗药物注射液：环磷酰胺(德国Baxter Oncology GmbH公司)，阿糖胞苷(美国辉瑞制药有限公司)，氟尿嘧啶(天津金耀药业有限公司)，卡铂、依托泊苷(山东齐鲁制药有限公司)，长春新碱(深圳万乐药业有限公司)，紫杉醇(江苏奥赛康药业有限公司)，多西他赛、奥沙利铂、伊立替康(江苏恒瑞医药股份有限公司)，吉西他滨、顺铂、地西他滨、硼替佐米、培美曲塞二钠(江苏豪森药业有限公司)，奈达铂(南京先声药业有限公司)，郝赛汀(上海罗氏制药有限公司)。0.9% 氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)。

1.2 方法

在初筛实验中，17种临床化疗药物注射液作为干扰组，实验体系中使用的药物浓度均以临床治疗浓度为参照，即环磷酰胺为12 mg/mL，阿糖胞苷为20 mg/mL，氟尿嘧啶为20 mg/mL，吉西他滨为16 mg/mL，地西他滨为1 mg/mL，依托泊苷为0.2 mg/mL，长春新碱为0.008 mg/mL，紫杉醇为0.42 mg/mL，多西他赛为0.32 mg/mL，顺铂为0.1 mg/mL，奥沙利铂为0.4 mg/mL，卡铂为0.4 mg/mL，奈达铂为0.08 mg/mL，伊立替康为1 mg/mL，硼替佐米为1 mg/mL，郝赛汀为1.56 mg/mL，培美曲塞二钠为8 mg/mL。在药物剂量影响实验中，对上述干扰阳性药物用生理盐水做进一步的75%、50%、25%梯度浓度稀释。在药物血样峰浓度的验证实验中，紫杉醇、多西他赛药物峰浓度进一步稀释至4 μg/mL。

取上述药物各100 μL，以0.9%氯化钠注射液为空白对照组，分别加入辣根过氧化物酶(HRP)+ 四甲基联苯胺(TMB)反应体系以及碱性磷酸酶(ALP)+3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(AMPPD)反应体系中，两种酶反应体系按试剂盒步骤严格操作。用Multiskan GO型酶标仪(美国Thermo公司)和SYNERGY H1型多功能化学发光仪(美国BioTek公司)检测对应D(450 nm)值以及相对发光强度。每个样本重复检测3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 化疗药物对HRP+TMB和ALP+AMPPD酶反应体系的影响

在HRP+TMB酶反应体系中，培美曲塞二钠因与终止液发生反应未列入统计，其余16种化疗药物在临床治疗浓度情况下对该酶反应体系的影响结果见图1。与对照组相比，吉西他滨、硼替佐米、多西他赛、紫杉醇、氟尿嘧啶、依托泊苷呈负向干扰，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，其抑制敏感顺序为：氟尿嘧啶>紫杉醇>吉西他滨>依托泊苷>多西他赛>硼替佐米。而顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、郝赛汀、伊立替康、地西他滨、阿糖胞苷、环磷酰胺、长春新碱与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。

在ALP+AMPPD酶反应体系中，17种化疗药物在临床治疗浓度情况下对该酶反应体系的影响结果见图2。与对照组相比，硼替佐米、多西他赛、紫杉醇、依托泊苷、伊立替康、地西他滨、培美曲塞二钠均呈明显负向干扰(P<0.05或P<0.01)，其抑制敏感顺序为：紫杉醇>地西他滨>培美曲塞二钠>多西他赛>伊立替康>依托泊苷>硼替佐米。而吉西他滨、顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、郝赛汀、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、环磷酰胺、长春新碱则无明显干扰作用(P>0.05)。从以上结果来看，化疗药物对酶反应体系干扰作用表现在对酶催化活性的抑制，且在两种不同的酶反应体系中，干扰药物的种类及敏感性也不尽相同。

a：P<0.05，b：P<0.01,与对照组相比

a：P<0.05，b：P<0.01,与对照组相比

2.2 化疗药物的剂量干扰效应观察

对酶反应体系有抑制作用的化疗药物进行75%、50%、25%的梯度浓度稀释，以观察该药物的剂量干扰效应。结果见图3。 HRP+TMB酶反应体系中，吉西他滨、多西他赛、紫杉醇、氟尿嘧啶、依托泊苷均呈剂量依赖的干扰效应，而硼替佐米无剂量依赖的干扰效应。其中，以25%稀释度为判断点，紫杉醇、吉西他滨的干扰效应最为明显。ALP+AMPPD酶反应体系中，多西他赛、紫杉醇、伊立替康、地西他滨、培美曲塞二钠均呈剂量依赖的干扰效应，而依托泊苷、硼替佐米则无剂量依赖的干扰效应，其中，以25%稀释度为判断点，紫杉醇、培美曲塞二钠的干扰效应最为明显。

A：HRP+TMB；B：ALP+AMPPD

2.3 化疗药物在血峰浓度时的干扰验证实验

对酶反应体系有明显剂量干扰作用的化疗药物进一步稀释至该药物在人体血样峰浓度的水平，以进一步验证在体液标本状态下该药物浓度对酶促反应的干扰作用。结果显示：在HRP+TMB酶反应体系中，与对照组相比，吉西他滨(10 μg/mL)、氟尿嘧啶(13 μg/mL)、依托泊苷(5 μg/mL)在其对应人体血峰浓度水平时干扰无统计学意义(P>0.05)；多西他赛和紫杉醇药物浓度稀释至在人体峰浓度水平时(即4 μg/mL)干扰有统计学意义(P<0.05)；在ALP+AMPPD酶反应体系中，与对照组相比，依托泊苷(5 μg/mL)、伊立替康(7.75 μg/mL)、地西他滨(3.20 μg/mL)、培美曲塞二钠(33 μg/mL)在其对应人体血峰浓度水平时干扰无统计学意义(P>0.05)；而多西他赛和紫杉醇药物浓度稀释至在人体血峰浓度水平时(即4 μg/mL)干扰有统计学意义(P<0.05)。同时，多西他赛和紫杉醇的干扰效应呈阈值特征：即当多西他赛>26.66 μg/mL，在HRP+TMB和ALP+AMPPD酶反应体系中干扰效应可分别达到-17.3%和-26.35%；当紫杉醇>13.12 μg/mL，在HRP+TMB和ALP+AMPPD酶反应体系中干扰效应可分别达到-29.91%和-27.53%。见图4。

*：P<0.001，与对照组相比

3 讨论

标记免疫分析技术是目前临床常用的实验室超微量检测方法，如化学发光标记免疫分析法、酶标记免疫分析法。HRP与ALP是酶标记免疫分析法中常见的标记酶，在临床检验中广泛应用[5]。酶是一类生物催化剂，其催化功能具有强大的信号放大作用，提高了检测技术的灵敏度，但易受反应体系中干扰物的影响而失活，对检测结果造成了严重影响。在肿瘤患者化疗过程中，使用标记免疫分析技术检测肿瘤标志物及其他肿瘤相关指标进行疾病疗效的判断是临床常规手段，因此，其结果的准确性会对临床医疗决策带来重大影响。

免疫测定方法的结果会受到特异性或非特异性干扰的影响，干扰效率从0.4%到4.0%不同[6]。在免疫测定系统中，由于标本来源的干扰而产生的不规则分析错误不仅是可变和零星的，而且在临床上具有误导性，因为它们会导致假阳性和假阴性结果[7]。侯立安等[8]研究表明，药物对酶法检测游离脂肪酸存在负干扰。为了应对干扰，免疫检测专家们进行了各种尝试，稀释实验或采用其他方法进行分析是两种最常用的解决方法[9]。Vogeser等[10]建议将偏离样本参考测量程序的结果定义为不规则(个别)分析误差，以解决个别样品中这种分析干扰的潜在原因和性质。然而，标记免疫分析方法的主要项目如肽激素，血浆蛋白，心功能、肾功能或肿瘤相关标志物的检测目前还没有参考测量程序[11]。因此，药物对免疫分析的干扰依然是一个难以提前预警的问题。

本研究对临床常用的17种化疗药物对标记酶免疫反应体系的干扰进行了分析。通过体外干扰实验证实了抗代谢药(氟尿嘧啶、吉西他滨)，抗肿瘤抗生素(依托泊苷)，抗肿瘤植物成分药(紫杉醇、多西他赛)，抗肿瘤靶向药(硼替佐米)对HRP酶活性有抑制作用。同时，抗代谢药(地西他滨)，抗肿瘤抗生素(依托泊苷)，抗肿瘤植物成分药(紫杉醇、多西他赛)，其他抗肿瘤药(伊立替康)，抗肿瘤靶向药(硼替佐米、培美曲塞二钠)对ALP酶活性有抑制作用。进一步分析显示，多西他赛及紫杉醇在体内血样峰浓度时仍对这两种酶反应体系有明显的抑制作用，推测与多西他赛及紫杉醇同属于紫杉烷类药物有关。多西他赛和紫杉醇在人体血样药物峰浓度时引起的干扰效应需要临床检验工作者和临床医生高度重视，因为两者皆为抗肿瘤常用药(特别是白蛋白紫杉醇相较紫杉醇注射液，最大血液药物浓度增加了6.5倍[12])。因此，对使用该类药物的患者，在评估酶标记免疫分析结果时应格外谨慎，特别是采用竞争法免疫反应时常引起错误的高值结果，给临床治疗工作带来了严重误导。

总之，药物干扰免疫分析是多种多样的。药物经人体代谢后形成多种代谢物，且存在不同的个体差异，化疗药物的联合应用，这些都对分析人体内药物对酶免疫检测结果的影响造成一定的困难。当然，随着质谱等新兴技术的成熟与发展，了解体内药物变化和提高免疫分析准确性成为可能。但是，相对于质谱的高成本、高操作难度、特定仪器或技术等高要求，免疫分析仍是临床最常用的方法。综上，化疗药物对免疫技术分析中标记酶活性的直接干扰是临床医生和检验工作者值得注意的问题，对实验室结果进行评估时应密切联系临床。