宿主整合因子对伤寒沙门菌动力的影响

徐国新，朱晓珏，王芳，陈龙

(1. 苏州大学附属张家港医院检验科，江苏 张家港 215600； 2. 张家港市中医医院检验科，江苏 张家港 215600)

伤寒沙门菌(Salmonellaentericaserovar Typhi,S. Typhi)属于肠杆菌科沙门菌属，常通过污染的食物或水进入人体消化道，进而引起全身性的感染症状——伤寒热[1-2]。伤寒沙门菌经口摄入，经胃酸、小肠高渗透压等不利环境因素后侵入回肠、盲肠及结肠末端。鞭毛是细菌的动力装置，在伤寒沙门菌致病过程中起着重要作用。鞭毛帮助细菌抵抗环境因素杀伤的同时，参与伤寒沙门菌对肠上皮细胞的侵袭[3]。伤寒沙门菌的鞭毛调控网络复杂，受多种全局调控因子甚至非编码RNA调控[4-6]。宿主整合因子(integration host factor，IHF)作为伤寒沙门菌的全局调控因子之一，含有HimA、HimD两个亚基。IHF能调控伤寒沙门菌多种基因尤其是毒力基因的转录表达[7]。但是，IHF对于伤寒沙门菌动力的影响及鞭毛基因的调控作用仍不清楚。本研究通过分析IHF对鞭毛基因的调控作用，初步探讨其对伤寒沙门菌动力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 伤寒沙门菌野生株(GIFU10007)、缺失株△himA、△himD为本实验室保存；pBAD33质粒由江苏大学黄新祥教授惠赠；异源表达载体pBAD33用以构建载体himA-pBAD、himD-pBAD，分别转化入△himA、△himD构建相应回补株himA-C、himD-C；空载体pBAD33转化入野生株及缺失株作为空白对照。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶XhoⅠ、EcoR Ⅰ及T4DNA连接酶、反转录试剂盒、DL2000 DNA标准参照物、反转录酶及嵌合荧光染料购自TaKaRa(大连)公司；高保真DNA聚合酶、TaqMix购自南京诺唯赞公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(美国Axygen公司)；氯霉素(美国Sigma公司)；PCR产物纯化试剂盒(德国Qiagen公司)；Trizol试剂及RNA纯化试剂盒(美国Invitrogen公司)。

1.1.3 主要仪器 凝胶成像系统(美国Gene公司，型号Gene Genius Bio Imaging System)；PCR仪(美国ABI公司，型号ABI 2700)；电转化仪(美国Bio-rad公司，型号GENE PULSER Ⅱ)；荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司)；微量核酸分光光度计(美国Thermo公司，型号NanoDrop-1000)；引物由苏州泓迅生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 回补株构建 以S. Typhi GIFU10007野生株作为模板，使用上游引物：5′-CGCTCGAGATGGCGCTTACAAAAGCTGA-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)与下游引物：5′-CGGAATTCTTACTCTTCTTTGGGCGA-3′(下划线为EcoR Ⅰ酶切位点)PCR扩增得到himA的编码区域序列，使用上游引物：5′-CGCTCGAGATGACCAAGTCAGAATTGAT-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)与下游引物：5′-CGGAATTCTTAACCGTAAATATTGGCGCGAT-3′(下划线为EcoRⅠ酶切位点)PCR扩增得到himD的编码区域序列；PCR产物经纯化后与异源表达载体pBAD33分别酶切，酶切产物经T4连接酶连接成重组质粒，PCR筛选阳性载体，测序验证正确即成功构建回补质粒；回补质粒电转化导入伤寒沙门菌野生株，PCR验证携带了重组质粒的克隆，即构建成功回补株himA-C、himD-C。野生株导入pBAD33空质粒作为对照，记为WT-pBAD。

1.2.2 动力实验 接种WT-pBAD、△himA-pBAD、△himD-pBAD、himA-C、himD-C单克隆至2 mL LB肉汤，37 ℃，250 r/min振摇培养过夜；次日以1∶100转接种于新鲜LB肉汤，250 r/min振摇培养约2 h至D(600 nm)≈0.4；加入阿拉伯糖(终浓度1 mmol/L)继续培养0.5 h以诱导异源表达载体。取菌液1 μL接种于0.3%琼脂半固体培养基(含1 mmol/L阿拉伯糖)孵育12 h；量取动力圈直径，进行统计学分析；通过动力圈直径比较细菌动力。

1.2.3 细菌总RNA提取及反转录 挑取单菌落WT-pBAD、△himA-pBAD、△himD-pBAD，接种至2 mL LB肉汤，37 ℃，250 r/min振摇培养过夜；以1∶100转接于新鲜LB肉汤，250 r/min振摇培养至D(600 nm)≈0.4；加入阿拉伯糖(终浓度1 mmol/L)诱导0.5 h；4 ℃，4 000 r/min，离心10 min收集细菌。用Trizol提取细菌总RNA，并用RNA纯化试剂盒消化残存的DNA，核酸分析仪分析提取的RNA浓度及纯度；取4 μg RNA，根据反转录试剂盒说明书，将RNA反转录成cDNA，反应体系10 μL，反应条件：25 ℃、15 min，85 ℃、5 s。

1.2.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析鞭毛基因flhD、fliA和fljB反应体系20 μL，其中嵌合荧光染料预混液10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA模版2 μL，双蒸水6.4 μL，以上反应液配置均在冰上进行。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。利用2-△△Ct计算法得到mRNA相对表达量。所用引物序列如下：flhD上游引物5′-AGCGTTTGATCGTCCAG-3′，下游引物CGTCCACTTCATTGAGCA-3′；fliA上游引物5′-CGACCGATATGACGCTTTGC-3′，下游引物5′-TTCCCGCCACTCATCGTAAG-3′；fljB上游引物5′-CAACCGCTAGTGATTTAGTTT-3′，下游引物5′-CTGTCCCTGTAGTAGCCGTAC-3′；5S上游引物5′-TTGTCTGGCGGCAGTAGC-3′，下游引物5′-TTTGATGCCTGGCAGTTC-3′。每组实验至少重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 伤寒沙门菌回补株himA-C和himD-C的构建

结果如图1所示，成功构建含有himA、himD编码片段的pBAD33回补质粒，并经测序验证正确。将回补质粒利用电转化的方式导入相应基因缺失株，即成功构建回补株himA-C、himD-C。

1：PCR验证；2：质粒酶切验证；M：DNA标准参照物

2.2 himA和himD缺失后对伤寒沙门菌动力的影响

动力实验结果如图2显示，与WT-pBAD相比，△himA-pBAD与△himD-pBAD的动力圈直径明显减小(t=14.00，10.58，P均<0.05)，himA-C、himD-C的动力圈与WT-pBAD基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，himA和himD对伤寒沙门菌的动力起促进作用。

2.3 himA和himD对伤寒沙门菌鞭毛基因mRNA表达的影响

qRT-PCR结果如图3显示，△himA-pBAD中鞭毛基因flhD、fliA、fljB的mRNA表达水平均明显低于WT-pBAD(t=9.55，8.1，11.25，P<0.05或<0.01)；△himD-pBAD中flhD、fliA、fljB的mRNA表达水平同样明显低于WT-pBAD(t=10.2，8.1，12.5，P<0.05或<0.01)。由此表明，himA和himD均能够正向调节伤寒沙门菌鞭毛基因flhD，fliA和fljB等mRNA表达。

图2 伤寒沙门菌动力实验

图3 qRT-PCR检测各菌株中鞭毛基因flhD，fliA和fljB的mRNA表达

3 讨论

IHF作为全局调控因子，在多种细菌的基因调控网络中起重要重用，参与致病进程。在新月柄杆菌中，IHF抑制细菌动力；在大肠埃希菌和鼠伤寒沙门菌中，IHF激活细菌动力[8-9]。伤寒沙门菌是一种具有双相鞭毛革兰阴性菌，其鞭毛的构成及功能有特殊性[10]。本研究发现，缺失himA或himD后，伤寒沙门菌动力明显减弱，表明IHF能够促进伤寒沙门菌的动力。

鞭毛是细菌重要的动力器官，在致病过程中发挥重要功能，如细菌定植和侵袭、感染位点的维持、感染后的扩散等[11]。伤寒沙门菌鞭毛的调控机制复杂，有50余个基因参与鞭毛的合成，按照转录调控级别可分为三级。本研究选取的flhD、fliA和fljB分别属于伤寒沙门菌的一、二、三级鞭毛基因，其中fljB为伤寒沙门菌GIFU10007所特有H:z66的编码基因[10]。本研究结果显示，himA和himD均能够正向调节伤寒沙门菌鞭毛基因flhD，fliA和fljB等mRNA表达。

调控因子对靶基因的调节方式有直接与间接两种方式，前者是指调控因子能够直接结合到靶基因的启动子序列，调节转录；后者则通过调节其他调控因子，影响靶基因转录[12]。后续研究中，我们将表达IHF蛋白，分析IHF对于鞭毛基因的调控方式。

综上所述，本研究初步揭示宿主整合因子IHF能够增强伤寒沙门菌的动力，并正向调节鞭毛基因的转录。