金黄色葡萄球菌SarA蛋白原核表达及免疫原性研究

程 旭，杨雨晴，吴赛男，侯勤龙，2，李咏梅，2，韩慧明，2

(1.北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013；2.北华大学基础医学院感染与免疫研究中心，吉林 吉林 132013)

生物膜是细菌在宿主体内生存的一种形式[1]，细菌生物膜的形成是导致长期感染的主要致病机制[2].有研究[3-4]表明：由金黄色葡萄球菌(金葡菌)导致的细菌生物膜感染逐年增多，而金葡菌生物膜的形成过程十分复杂，受众多基因及因子的共同调控[5].金葡菌生物膜的主要成分有多糖PIA(polysaccharide intercellular adhesion)、细菌表面分泌的细菌蛋白以及细胞外DNA[6].

在金葡菌中主要存在2类调控系统：一类是双组分调控系统(Two component regulatory system，TCRS)[7]，另一类是葡萄球菌附属蛋白调控系统(SarA 蛋白家族类，Stapphylococcal accessory protein regulator)[8].SarA是SarA蛋白家族的第一个成员，该家族包括已经研究较为清楚的SarA、SarR、SarS、SarT、SarU以及功能尚不明确的SarV、SarX、SarY 和 SarZ[9].SarA是一种二聚体DNA结合蛋白，可与靶基因的启动子区域结合后发挥调控作用.有研究[10]发现：它在毒力基因调控系统中具有至关重要的作用，直接或间接调控的基因有120个，其中76个基因表达上调，44个基因表达下调.SarA不仅可以促进ica(intercellular adhesin locus)的转录，还能在不含有ica操纵子的条件下促进agr(accessory gene regulator)调节系统的表达，而agr系统可以减弱金葡菌形成生物膜的能力，所以，SarA可以影响生物膜的形成[6].除此之外，SarA还可以通过调节生物膜相关蛋白及纤连蛋白结合蛋白等表达，同样使细菌生物膜的形成能力减弱[11-12]，目前，已研究出针对SarA设计的生物膜抑制剂[3，13].

1 材料与方法

1.1 试验材料

金黄色葡萄球菌菌种(ATCC 6538，中国普通微生物菌种保藏管理中心保存)；质粒pET32a(+)(北华大学基础医学院实验室保存)；大肠杆菌DH5α感受态(索莱宝生物技术有限公司)；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉(Oxoid公司，英国)、氨苄西林(100 mg/mL)、卡那霉素(50 mg/mL)、基因组小提试剂盒、IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、弗氏(不)完全佐剂、限制性内切酶BamH I、XhoI(碧云天生物技术有限公司)；凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)；pEGM-T(promega)、HRP标记羊抗兔IgG(ABclonal，美国).

1.2 试验方法

1.2.1 SarA蛋白序列分析

通过NCBI获取SarA(Genbank：AAB21606.1)基因序列，采用TMHMM Server V2.0软件分析SarA蛋白的跨膜结构；应用抗原决定簇预测软件分析SarA蛋白的抗原表位.

1.2.2 引物设计

通过分析目的基因以及原核表达载体序列，选择共有的BamH I、XhoI作为酶切位点，在目的基因的上下游分别加上BamH I、XhoI酶切位点及保护性碱基，引物序列见表1.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 PCR扩增并回收目的片段与T载体连接

将金葡菌ATCC 6538菌株进行菌种复苏，用基因组小提试剂盒进行金葡菌基因组提取，以基因组为模板，用P1和P2进行PCR扩增目的片段SarA.扩增体系见表2.反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 30 s，42.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s，10个循环；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，20个循环；72 ℃充分延伸10 min.

表2 SarA基因扩增体系Tab.2 SarA gene amplification system

吸取1 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确的目的片段加A尾，每50 μL体系加5.0 μL dNTP、5.0 μL 10×Taq buffer、2.0 μL Taq酶，95 ℃ 2 min，72 ℃ 30 min.将已加A尾的目的基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶显色并切胶后，用天根胶回收试剂盒回收PCR扩增产物.按照pGEM-T Vector说明书将SarA纯化产物与pGEM-T进行连接，将连接产物转化至DH 5α感受态细胞中，并涂布于氨苄平板上，于37 ℃培养箱中培养16～18 h.

1.2.4 T载体重组质粒连接、菌液PCR及双酶切鉴定

挑取多个白色单克隆，置于200 μL含有氨苄的抗菌药物液体LB培养基中，37 ℃ 200 r/min过夜，震荡培养.次日，吸取2 μL菌液作为模板，进行菌液PCR鉴定，PCR反应体系和反应程序同1.2.3.若菌液PCR鉴定为阳性，则吸取5 μL相应阳性菌液，置于5 mL 含有5 μL氨苄抗菌药物的液体LB中，37 ℃ 200 r/min过夜震荡培养.次日，用Omega质粒提取试剂盒提取质粒，37 ℃酶切4 h，凝胶电泳鉴定.最后将酶切正确的质粒菌液进行测序.

1.3 SarA-pET32a(+)原核表达载体的构建及IPTG诱导表达

1.3.1 SarA-pET32a(+)原核表达载体的构建

将方法1.2.4测序正确的SarA-T质粒与pET32a(+)质粒分别用BamH I、XhoI双酶切，行琼脂糖凝胶电泳，对SarA基因片段与pET32a(+)载体片段进行回收、纯化，16 ℃ 过夜连接.连接完成后，将连接产物转化于DH5α感受态中，涂布于卡那霉素抗性平板上，37 ℃ 过夜培养.次日，挑取阳性克隆进行菌液PCR鉴定和酶切鉴定，方法同1.2.4.

1.3.2 IPTG诱导蛋白原核表达及蛋白纯化

将SarA-pET32a(+)转化至BL21(DE3)感受态中，涂布于含氨苄抗菌药物的LB平板上，37 ℃倒置培养16～18 h.挑取单克隆接种至10 mL液体LB培养基中，37 ℃摇床，180 r/min过夜震荡.次日，将10 mL菌液于1 L LB液体培养基中扩大培养，37 ℃摇床，200 r/min，当OD600达到0.5时，向1 L菌液中加入1 mL IPTG(终浓度为1 mmol)，16 ℃摇床，130 r/min过夜诱导.次日，4 ℃ 4 500 r/min离心10 min，弃去上清，将菌液沉淀置于冰上，加入Binding Buffer和PMSF混合液进行超声.超声后，4 500 r/min离心25 min，将上清与沉淀分离，再用Binding Buffer和PMSF混合液重悬沉淀；再次超声、离心，将上清液混合.取上清与沉淀，行SDS-PAGE检测.利用亲和层析法纯化蛋白，分别用100、200、300、400、500 mmol咪唑洗脱，最后选择500 mmol咪唑进行洗脱，将超滤浓缩管浓缩洗脱下来的蛋白样品应用BCA试剂盒检测其蛋白浓度，用于多克隆抗体制备.

1.3.3 多克隆抗体的制备、血清效价及Western blot鉴定

首次免疫：将免疫原SarA重组蛋白与弗氏完全佐剂1∶1混合，选择家兔脊柱两侧共10个位点，每个位点注射0.2 mL蛋白浓缩液(800 μg/次).3周后加强免疫，免疫原与弗氏不完全佐剂1∶1混合，免疫原的量是首次免疫量的50%(400 μg/次)，加强免疫3次.末次免疫1周后颈动脉取血，收集血清，进行间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)，检测血清抗体效价.以SarA纯化蛋白为抗原，12% SDS-PAGE进行电泳，将目的条带转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶孵育1 h，兔免疫血清为一抗，4 ℃过夜孵育，HRP标记山羊抗兔抗体为二抗，室温孵育1 h，并行Western blot鉴定.

2 结 果

2.1 SarA蛋白序列分析

SarA基因编码113个氨基酸，蛋白分子量为13.44 kDa，以二聚体形式存在，通过生物信息学软件对SarA蛋白进行跨膜结构域和抗原表位分析.见图1a.SarA基因编码的蛋白区域均位于transme- mbrane线以下，未发现跨膜结构域，为胞内蛋白，可以选取基因全长的片段进行表达.见图1b.该抗原决定簇预测软件集成了以下5种算法：Kolaskar & Tongaonkar：分析蛋白的抗原指数；Parker：亲水性预测；Chou-Fasman：蛋白质二级结构；Karplus & Schulz：柔韧性预测；Emini：表面可及性预测.综合以上5种算法，结果显示后四者均有大部分重叠，而抗原指数预测与其相反，易形成抗原表位.本研究结果表明：选择SarA作为目标蛋白，其具有较强的免疫原性，容易刺激机体免疫系统产生抗体，故以其为模板构建DAN疫苗具有较强的可行性.

图1SarA基因编码蛋白的跨膜及抗原表位分析Fig.1Transmembrane and epitope analysis of protein encoded by SarA gene

2.2 目的基因片段的获取

金葡菌菌种复苏后，进行基因组DNA提取，以此为模板扩增出目的基因片段SarA(342 bp)，条带在正确位置.见图2.

M.DL2000；1.SarA基因.图2SarA基因PCR结果Fig.2SarA gene PCR result

2.3 目的基因的T载体克隆、鉴定及测序

将PCR扩增产物SarA回收，回收后与T载体连接，连接后进行菌液PCR鉴定，PCR结果可见克隆条带与以基因组为模板的阳性对照条带大小一致.见图3.

M.DL2000；1.阴性对照；2.阳性对照；3～6.SarA-T阳性克隆.图3SarA-T重组质粒菌液PCR结果Fig.3PCR result of SarA-T recombinant plasmid

选择菌液PCR鉴定为阳性克隆的样品各两个，进行摇菌，提取质粒，质粒分别用BamH I和XhoI内切酶双酶切鉴定.酶切后分别有两条条带，一条为T载体条带，一条为目的条带.见图4.选取的菌液行PCR鉴定以及质粒双酶切鉴定，结果均为阳性.将菌液送于上海生工生物工程有限公司进行测序，通过比对，结果与Genbank中SarA序列一致.

M.DL2000；1、3.SarA-T未酶切质粒；2、4.SarA-T 双酶切质粒阳性结果.图4SarA-T重组质粒双酶切鉴定结果Fig.4Identification results of SarA-T recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.4 SarA-pET32a(+)原核重组质粒的构建

将测序正确的SarA-T质粒和pET32a(+)质粒用BamH I/XhoI内切酶进行双酶切，回收目的片段SarA，分别与酶切后的pET32a(+)质粒载体连接；连接产物转化，进行双酶切鉴定.见图5.第2、4泳道上为pET 32a(+)载体条带，下为目的条带.

M.DL2000；1、3.SarA-pET32a(+)未酶切质粒；2、4.SarA-pET32a(+) 双酶切质粒阳性结果.图5SarA-pET32a(+)重组质粒双酶切鉴定结果Fig.5Identification results of SarA-pET32a(+) recom- binant plasmid by double enzyme digestions

2.5 SarA蛋白的原核表达

将鉴定正确的SarA-pET32a(+)原核重组质粒进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测结果见图6.SarA蛋白在16 ℃诱导(相较于37 ℃诱导)条件下可溶性蛋白表达量更高.SarA的理论分子量约为14 kDa，正常条件下以二聚体形式表达，SDS-PAGE检测蛋白表达分子量在32 kDa左右.由于SarA蛋白与pET32a(+)原核表达载体形成融合蛋白，pET32a(+)T7启动子后含有一个thrombin位点、6×His标签、TrXA位点、Ek位点和S标签.

M.蛋白分子量；1.SarA重组菌体未诱导(37 ℃)；2.SarA重组菌体诱导(37 ℃)；3.SarA重组菌体的裂解液上清(37 ℃)；4.SarA重组菌体的裂解液沉淀(37 ℃)；5.SarA重组菌体未诱导(16 ℃)；6.SarA重组菌体诱导(16 ℃)；7.SarA重组菌体的裂解液上清(16 ℃)；8.SarA重组菌体的裂解液沉淀(16 ℃)；9.BL21菌体(37 ℃).图6SarA-pET32a(+) IPTG诱导表达产物的 SDS-PAGE分析Fig.6SDS-PAGE analysis of SarA-pET32a (+) IPTG-induced expression products

为进行多克隆抗体的制备，利用镍柱亲和层析法纯化16 ℃诱导表达的SarA可溶性蛋白，分别用100、200、300、400 mmol和500 mmol咪唑洗脱.相同条件下，500 mmol咪唑洗脱的蛋白量最多，将洗脱的蛋白样品使用10 kDa超滤浓缩管浓缩，浓缩后进行SDS-PAGE鉴定，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，用于多克隆抗体制备.见图7.

M. 蛋白分子量；1. 100 mmol咪唑洗脱液；2. 200 mmol咪唑洗脱液；3. 300 mmol咪唑洗脱液；4. 400 mmol咪唑洗脱液；5. 500 mmol咪唑洗脱液.图7SarA蛋白咪唑浓度梯度纯化结果Fig.7Results of SarA protein purified by different imidazole concentrations

2.6 ELISA间接法检测血清抗体效价

按一定比例的包被液稀释抗原SarA蛋白浓度至10 μg/mL，家兔阴性血清做对照，将待检血清按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、…、1∶512 000稀释作为一抗，二抗为HRP标记羊抗兔IgG(1∶5 000)，加TMB底物显蓝色，37 ℃孵育10 min后加入终止液，颜色变黄后应用酶标仪测定450 nm处各孔的吸光度值，绘制标准曲线，由图8可见血清抗体效价达到1∶512 000.

图8免疫动物血清抗体效价Fig.8Serum antibody titer of immunized animals

2.7 多克隆抗体的Western blot鉴定

免疫后的家兔颈动脉取血，收集血清，并作为一抗(1∶2 000)；以未注射SarA蛋白的家兔血清作为阴性对照，HRP标记山羊抗兔抗体为二抗(1∶3 000).Western blot鉴定结果显示阴性对照无任何条带，在34 kDa位置附近能显示出特异SarA蛋白条带，说明本实验已成功制备了良好特异性的SarA蛋白血清多克隆抗体.见图9.

M.预染低分子量蛋白标准；1.兔免疫血清；2.阴性血清.图9兔血清抗体Western blot检测Fig.9Western blot results of rabbit serum

3 结 论

细菌生物膜可引起严重的耐药现象，进而形成难治性感染，细菌生物膜作为细菌耐药的重要机制之一已引起广泛关注，成为近年来细菌耐药机制研究的热点.虽然关于生物膜的形成机制已有很多研究，也认识一些在这一过程中起作用的关键基因，但对于如何有效抑制生物膜形成的细节还缺乏更深入的研究[14].

有研究[15]发现：在金葡菌中，特异性敲除SarA基因可使细菌生物膜形成的能力减弱，且增加了金葡菌对抗菌药物敏感性，这表明SarA在细菌生物膜的形成过程中具有至关重要的作用.本研究将SarA基因作为靶基因，通过对SarA的跨膜结构域以及抗原表位的生物信息学分析及预测，可知SarA蛋白不具有跨膜区域，二级结构主要由α螺旋和β折叠组成.在α-螺旋和β-折叠区域的间隙存在容易形成抗原表位的β-转角和无规卷曲区域，且该蛋白的C端具有较好的柔性、亲水性(≥0.5)和表面可及性(≥1)，抗原指数也较高，分布较均匀，易形成抗原表位，与抗体结合的可能性较大.

本实验成功构建了金葡菌SarA基因的原核表达载体，并在大肠杆菌细胞中呈可溶性表达，通过对其诱导温度的改变，得到诱导温度为16 ℃时，包涵体蛋白较37 ℃时减少，可溶性蛋白量增加，这可能是由于低温会降低蛋白质的表达速度，并促进蛋白质的正确折叠[16].诱导SarA融合蛋白，并应用6xHis亲和层析技术获得较高纯度的免疫原，免疫原结合弗氏(不)完全佐剂免疫家兔后，弗氏佐剂不仅可以使抗原持续缓慢的释放，又能非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答.本实验结果表明：研究中所表达纯化的可溶性SarA蛋白具有极强的免疫原性，通过间接ELISA实验和Western blot实验得到了高效价和良好特异性的多克隆抗体.

综上所述，SarA作为目标蛋白构建DAN疫苗具有可行性，可能会有效刺激机体的细胞免疫和体液免疫.本研究为后续针对细菌生物膜消散的DNA疫苗研究奠定了基础，将对具有强耐药性的金葡菌感染的治疗提供临床参考价值.

致谢：本文是北华大学大学生创新创业训练项目(201811923138)研究成果的一部分，口腔医学院2017级田磊同学参加了本实验的研究工作.