意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制研究

滕 亮，李蒙华，马桂芝

(1.新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆 乌鲁木齐 830054；2. 陕西省人民医院药学部，陕西 西安 7100683.新疆医科大学药学院药物分析教研室，新疆 乌鲁木齐 830011)

近几年，我国心血管病死亡率居高不下，心血管病已成为危害人民群众健康的重要问题。溶栓治疗、经皮冠状动脉介入术或冠状动脉旁路移植术能充分的开通梗死相关血管，恢复缺血心肌的血液灌注，抢救濒临死亡的心肌，是缺血性心脏病、急性心肌梗死的最有效措施。但再灌注治疗在恢复冠脉血流的同时会加重组织损伤，出现心功能不全、心律失常、心肌梗死面积扩大等严重现象，这种现象称为心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)[1]，其损伤机制包括炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、细胞自噬及细胞焦亡等[2-5]。

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)为紫草科牛舌草属多年生草木植物，分布于地中海和热带地区，是维吾尔医治疗心脑血管疾病首选药材之一[6]。近期研究已证实意大利牛舌草总黄酮具有减少缺氧/复氧所致原代心肌细胞氧化应激损伤作用[7-8]，课题组进一步对意大利牛舌草总黄酮提取物进行了化学成分分离，获得多个单体化合物，如芦丁(含量为4.3%)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(含量为5.6%)、水仙苷(含量为3.8%)、迷迭香酸(含量为19.5%)，其中芦丁、水仙苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷均为黄酮类化合物[9]，具有明确的抗氧化、抗炎活性[10]，但其对缺氧/复氧所致原代心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及作用机制仍有待于研究。

因此，本研究以意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分(芦丁、迷迭香酸、水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷)为研究对象，观察其在体外对缺氧/复氧心肌细胞存活率、LDH水平、细胞内MDA含量和SOD的活力的影响，通过检测线粒体膜电位、心肌细胞凋亡、NF-κB信号通路关键蛋白与其凋亡、自噬、焦亡相关蛋白的表达，研究意大利牛舌草总黄酮及四种主要化学成分对缺氧/复氧所致原代心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及作用机制，为深入开展意大利牛舌草中活性成分的药理作用研究及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器DMI6000型全自动荧光倒置显微镜(德国Leica公司)；ChemiDoc MP凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)；台式低温冷冻高速离心机(美国Thermo Scientific公司)；MultiskanGo酶标仪(美国 Thermo Fisher Scientific公司)；FACSAria II流式细胞仪(美国BD公司)；恒温培养箱(美国Thermo Scientific公司)。

1.2 试剂芦丁对照品(批号MUST-18031811，质量分数≥98.00%)，山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品(批号MUST-18041504，质量分数≥98.06%)，水仙苷对照品(批号MUST-18070403，质量分数≥99.99%)，迷迭香酸对照品(批号MUST-18040508，质量分数≥99.30%)，葛根素(批号：16031432)均购自成都曼思特生物科技有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号：A020-2-2)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：A001-3-2)，丙二醛(MDA)试剂盒(批号：A003-4)均购自中国南京建成生物工程研究所；细胞凋亡检测试剂盒(BD Biosciences公司，批号：9009907)；细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(中国博士德生物工程有限公司，批号：AR1160-500)；DMEM培养基(美国Hyclone公司，批号：AE29427345)；胎牛血清(美国Giboco公司，批号：GR3289926)；鼠抗β-actin抗体(英国Abcam公司，批号：ab8226)；兔抗GAPDH抗体(美国Affinity公司，批号：620922)；兔抗NF-κB p65抗体(英国Abcam公司，批号：ab16502)；兔抗NF-κB p-p65抗体(英国Abcam公司，批号：ab86299)；兔抗Bcl-2抗体(英国Abcam公司，批号：ab59348)；兔抗Bax抗体(英国Abcam公司，批号：ab32503)；兔抗NF-κB1p50抗体(美国CST 公司，批号：13586)；兔抗IKκBα抗体(美国CST 公司，批号：4812)；兔抗p-IKκBα抗体(美国CST 公司，批号：2859)；兔抗Beclin-1抗体(美国CST 公司，批号：3495s)；兔抗IL-1β抗体(英国Abcam公司，批号：ab2105)；鼠抗GSDMDC1抗体(德国圣克鲁斯生物技术公司，批号：C2218)；鼠抗Caspase-1抗体(德国圣克鲁斯生物技术公司，批号：J1618)；抗鼠2抗(HRP)(美国CST 公司，批号：7056)；抗兔2抗(HRP)(美国CST 公司，批号：7074s)。

1.3 实验动物健康 SPF 级 SD大鼠乳鼠，雌雄各半，体质量( 6.49±2.06) g，鼠龄 1-3 d，均由新疆医科大学动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(新) 2019-0003。实验过程中对动物的处理均遵照科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中有关动物的使用及伦理学规定。

1.4 意大利牛舌草总黄酮的制备[9]取意大利牛舌草药材，粉碎后过40目筛，回流提取料液比为1 ∶20，提取溶剂为75%乙醇，提取时间为2 h，共提取2次。过滤后，合并滤液，浓缩至无醇味，冷冻干燥，即得意大利牛舌草总黄酮的粗提物。取1 BV浓度为20 g·L-1意大利牛舌草总黄酮粗提物溶液，上样至聚酰胺柱中，上样速度为2 BV·h-1，上样后静态吸附30 min，用足量蒸馏水去除杂质，以70%乙醇为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥至粉末状，即得总黄酮质量分数为72.81%的提取物。

1.5 原代乳鼠心肌细胞分离与培养[8]取1-3 d新生乳鼠心脏，剪为花瓣样后置于1 mL·L-1胰酶中4 ℃摇床消化过夜。次日用等体积的完全培养液中和胰酶后，加入0.8 mL·L-1Ⅱ型胶原酶置于37 ℃水浴摇床，使组织完全消化。收集上清液，离心，用完全培养液重悬得细胞悬液，接种于100 mm培养皿中，在CO2培养箱中差速贴壁2次纯化心肌细胞，收集未贴壁细胞，用细胞培养液将细胞浓度调整为2×106个·L-1，接种于100 mm的细胞培养皿中。置于常规培养箱(含5% CO2和95% O2)中静置培养48 h，培养时加入终浓度为10 mL·L-1Brdu抑制纤维细胞的生长。

1.6 分组与给药取培养48 h的原代心肌细胞饥饿12 h(无糖无血清培养基)，随机分为正常对照组(Control)、模型组(H/R model )、芦丁组(50 mg·L-1)、迷迭香酸组(25 mg·L-1)、水仙苷组(25 g·L-1)、山奈酚-3-O-芸香糖苷组(100 mg·L-1)、总黄酮组(50 mg·L-1)、葛根素组(阳性对照组，1240 mg·L-1)。

正常对照组(Control)将细胞用100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培养基正常培养。模型组(HR)将细胞置于缺氧密闭装置(含95% N2和5% CO2)中培养12 h(缺氧)，培养基更换为含100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培养基，置于常规培养箱中培养15 min(复氧)。空白组中无细胞，仅加入与各组等量的培养基，其余处理与模型组相同。药物干预组(芦丁组、迷迭香酸组、水仙苷组、山奈酚-3-O-芸香糖苷组、总黄酮组、葛根素组)均为给予细胞指定浓度的干预药物预处理一定时间后，参照模型组进行缺氧及复氧处理。

1.7 CCK-8法检测心肌细胞活力将各组细胞置于96孔板上，每组设6个复孔，按照1.6项下分组处理后，加入CCK-8溶液(100 μL·孔-1)继续培养2 h，于450 nm波长处测定吸光度值(A)，计算细胞存活率。细胞存活率/%= (A实验组- A空白组)/(A正常组- A空白组)×100%，重复测定3次。

1.8 LDH、MDA和SOD的测定收集各组细胞培养上清液，按照试剂盒说明书进行操作，测定LDH的水平。心肌细胞提取蛋白后，按照试剂盒说明书进行操作，测定SOD的活性和MDA的含量。

1.9 JC-1染色测定线粒体膜电位各组细胞进行相应处理后，弃去培养皿上清液，用37 ℃的无菌PBS清洗2遍；每个培养皿加入500 μL JC-1染色液，37 ℃恒温培养箱，孵育10min。取出培养皿，吸取JC-1染色液，弃去，用无菌PBS清洗，每次5 min，共洗3次；迅速拿至荧光倒置显微镜下进行拍照。各实验组每组3皿，重复3次。

1.10 流式细胞仪检测细胞凋亡各组细胞进行相应处理后，按照凋亡试剂盒说明书操作，采用流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.11 Western blot法测定心肌细胞中蛋白表达水平各组细胞进行相应处理后，按蛋白提取试剂盒操作说明提取细胞总蛋白，以BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量分析，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳对蛋白进行分离，电转移至硝酸纤维素膜上，5%的脱脂奶粉封闭膜1 h，4 ℃孵育一抗过夜，室温孵育二抗2 h，显色，通过凝胶成像分析仪对目的条带拍照，采用Image Lab 4.0灰度分析软件测定目标蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对缺氧/复氧原代心肌细胞存活率的影响Tab 1显示，相较于正常组，H/R模型组细胞存活率明显降低(P<0.01)；与模型组相比，药物干预组均可以增加H/R损伤细胞的存活率，差异有显著性(P<0.01)，提示芦丁、迷迭香酸、水仙苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、总黄酮均可提高损伤心细胞的活力。

2.2 意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对缺氧/复氧原代心肌细胞LDH、SOD、MDA的影响Tab 2显示，与正常对照组比较，经H/R处理后的模型组细胞LDH水平和MDA含量升高，SOD活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，提示H/R处

Tab 1 Effect of total flavonoids and four compounds on survival rate of cardiac myocytes exposed to

Tab 2 Effect of total flavonoids and four compounds on contents of LDH, MDA and activity of SOD of cardiac

理后对细胞造成了损伤；与模型组比较，药物干预组乳鼠心肌细胞LDH水平和MDA含量均明显降低，SOD活性均升高，差异有统计学意义(P<0.01)，说明药物干预可修复H/R造成的细胞损伤。

2.3 意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对缺氧/复氧原代心肌线粒体膜电位的影响Fig 1显示，心肌细胞在经过缺氧/复氧后，红色荧光与绿色荧光强度较正常组比例明显下降(P<0.01)，提示H/R可以导致心肌细胞线粒体膜电位的下降；与模型组比较，药物干预组的心肌细胞红色荧光/绿色荧光强度均增强(P<0.01)，提示各给药组可提高心肌细胞线粒体膜电位水平，进而稳定线粒体功能，发挥保护受损心肌细胞的作用。

2.4 意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对缺氧/复氧原代心肌细胞凋亡的影响Fig 2显示，相较于正常对照组，H/R模型组心肌细胞早期凋亡比例明显升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组细胞早期凋亡比例均明显下降(P<0.01)，说明各药物可通过减少心肌细胞早期凋亡发挥保护受损心肌细胞的作用。保护作用的强弱顺序依次为总黄酮>芦丁>葛根素>水仙苷>山奈酚-3-O-芸香糖苷>迷迭香酸。

Fig 1 Mitochondrial membrane potential of

2.5 意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对缺氧/复氧原代心肌细胞NF-κB信号通路蛋白的影响Fig 3显示，H/R后原代心肌细胞NF-κB被激活后，发生磷酸化， p-IκBα与IκBα比值较正常对照组明显减低，p-p65水平较正常对照组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，药物预处理后p-IκBα与IκBα比值表较H/R上调，p-p65水平较H/R组明显降低(P<0.01)，提示在H/R前进行给药干预可通过减少NF-κB的磷酸化有效抵抗缺氧/复氧造成的心肌细胞损伤。

2.6 意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对缺氧/复氧原代心肌细胞凋亡蛋白的影响Fig 4显示，相较于对照组，心肌细胞经过H/R后促凋亡蛋白Bax与抑制凋亡蛋白Bcl-2的比例明显增高，差异具有统计学意义(P<0.01)，给药组的Bax/Bcl-2的比例较模型组明显降低(P<0.01)，说明在H/R前进行给药干预可有效抵抗缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡。

2.7 意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对缺氧/复氧原代心肌细胞自噬相关蛋白的影响Fig 5显示，相较于对照组，心肌细胞经过H/R后自噬蛋白Beclin-1表达量明显增高，自噬蛋白p62表达量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，而给药组的Beclin-1蛋白表达量较模型组明显降低而p62表达上调(P<0.01)，说明在H/R前进行给药干预可通过抑制细胞自噬有效抵抗缺氧/复氧对心肌细胞的损伤。

2.8 意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分对缺氧/复氧原代心肌细胞焦亡相关蛋白的影响Fig 6结果显示，相较于对照组，心肌细胞经过H/R后NLRP3、IL-1β以及GSDMD表达量明显增高，差异具有统计学意义(P<0.01)，而给药组的NLRP3、IL-1β以及GSDMD表达量较模型组明显降低(P<0.01)，说明在H/R前进行给药干预有效抑制炎症小体的活性，进而减少炎症反应，降低心肌细胞焦亡。

3 讨论

MIRI发病机制复杂[2-5]，发生MIRI时，心肌细胞氧自由基增多，抗氧化能力降低。本实验结果表明，意大利牛舌草总黄酮及其主要成分芦丁、迷迭香酸、水仙苷、山奈酚3-O-芸香糖苷均能够提高心肌细胞的活力，抵抗心肌细胞的过度氧化，增强SOD的活力，且总黄酮对造模后细胞活力的提升和抗氧化应激能力高于4种单体成分，推测其对H/R损伤后细胞保护作用可能与总黄酮提取物中多种成分协同作用有关。

Fig 2 Primary cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation

在预实验中作者分别考察了意大利牛舌草总黄酮及其主要成分芦丁、迷迭香酸、水仙苷、山奈酚3-O-芸香糖苷的不同作用剂量(1、5、25、50、100、1 000 mg·L-1)与不同作用时间(1、3、5、7 h)对H/R损伤心肌细胞的保护作用。经优选，确定各受试物作用条件为：芦丁50 mg·L-1预处理3 h、迷迭香酸25 mg·L-1预处理3 h、水仙苷25 mg·L-1预处理3 h、山奈酚-3-O-芸香糖苷100 mg·L-1预处理3 h、总黄酮50 mg·L-1预处理1 h和阳性药葛根素1 240 mg·L-1预处理2 h。

心肌细胞凋亡是导致MIRI的一个重要因素，主要爆发于再灌注期间[11]，核转录因子NF-κB可促心肌细胞凋亡[3]。 NF-κB通常指由Rel蛋白家族的p50和p65组成的二聚体，是一种具有促进基因转录功能的蛋白质，许多基因启动子和增强子上具有功能性NF-κB的结合位点，包括与心肌缺血发生发展密切相关的TNF-α、白细胞介素和内皮粘附因子，参与免疫反应、炎症反应和细胞凋亡[12]。静止细胞中NF-κB与其抑制蛋白IκBk形成复合体，在细胞质中不起作用。当细胞受到细胞外炎症信号的刺激时， IκB 磷酸化并降解，NF-κB 游离，向细胞核内转移，诱导TNF-α、IL-1β等细胞因子的转录，对炎症反应起放大作用，进一步加重心肌细胞损伤，导致心肌细胞凋亡[13]。本文结果表明药物干预组心肌细胞中p-p65水平较H/R组明显降低，p-IκBα与IκBα比值较H/R组上调(P<0.01)，提示药物干预可减少心肌细胞凋亡，可能是通过抑制NF-κB信号通路，减少炎症因子释放而发挥作用。

Fig 3 Expression of NF-κB signaling pathway-related proteins detected by Western blot

Bcl-2家族主要包括促凋亡蛋白Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl两大类，Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因蛋白，其在线粒体内高度表达，维持线粒体内钙离子的稳态，阻止开放线粒体膜的通透性转换孔，达到对促进凋亡蛋白质释放的抑制，抑制细胞凋亡。Bax是促进细胞凋亡的基因蛋白，Bax的表达是通过和线粒体上Bcl-2结合成二聚体来发挥作用。当Bax表达增多时，Bax、Bax同源二聚体便可促进细胞凋亡，而Akt磷酸化使Bax表达减少时，Bcl-2、Bax异源二聚体便可抑制细胞凋亡[14]。本文结果显示，药物干预组心肌细胞的Bax/Bcl-2比例较模型组明显降低(P<0.01)，药物干预可有效抵抗缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的作用。

Fig 4 Expressions of apoptosis-related proteins detected by Western blot

Fig 5 Expressions of autophagy-related proteins detected by Western blot

Fig 6 Expressions of pyroptosis-related proteins detected by

细胞自噬是细胞程序性死亡的方式之一，自噬体是由粗面内质网或高尔基体中被双层膜包裹的蛋白质和细胞器裂解物形成的，主要功能是降解细胞内的多余的蛋白质和受损的细胞器，使细胞保持正常状态，同时为细胞提供一定的能量。但是，当这些反应过度发生时，出现过度自噬现象，最终导致细胞死亡，自噬在心脏细胞稳态及调节中起着重要作用[15]。本实验结果显示，给药组的自噬蛋白Beclin-1表达量较模型组明显降低，而自噬蛋白p62表达上调(P<0.01)，提示药物干预可通过抑制细胞自噬，有效抵抗缺氧/复氧对心肌细胞的损伤。

细胞焦亡是一种介于凋亡和坏死之间的伴随炎症反应的程序性细胞死亡形式，表现为细胞不断膨胀直至胞膜破裂，导致胞内容物的释放和强烈的炎症反应的激活。发生焦亡后的细胞，细胞核的核膜仍然保持完整，但会释放大量的IL-1β和IL-18，进而募集更多的炎症细胞，进一步增强炎症反应。MIRI发生时，NF-κB持续激活促进炎症小体NLRP3形成，炎症小体一旦形成，通过活化caspase-1进一步促进前体IL-1β及IL-18的成熟，使之形成有活性的IL-1β和IL-18，在GSDMD的介导下分泌到细胞外，募集炎症细胞，增强炎症反应，促使细胞肿胀，进而诱发细胞焦亡[16-17]，加重再灌注损伤。本实验结果显示，给药组的NLRP3、IL-1β以及GSDMD较模型组明显降低，提示药物干预可有效抑制炎症小体的活性，进而减少炎症反应，降低心肌细胞焦亡。

综上所述，本文结果表明意大利牛舌草总黄酮及四种化学成分可减轻H/R对心肌细胞造成的损伤，这种保护作用与抑制NF-κB信号通路的激活及心肌细胞的过度自噬、缓解细胞焦亡、减少心肌细胞凋亡有关。