TPGS修饰载精氨酸脱亚胺酶环糊精脂质纳米粒的酶活性和药动学研究

杨 强，冯 娇，刘煜莹，李开铃，钟彩灵，张景勍

(1. 重庆医科大学药学院，重庆 400016；2. 陆军军医大学第二附属医院药剂科，重庆 400036)

精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase，ADI)来源于各种微生物，如支原体、幽门螺杆菌等，是精氨酸专一水解酶，能将机体中精氨酸分解为瓜氨酸[1]。精氨酸属于半必需氨基酸，也是肿瘤生存的营养来源之一，在正常情况下机体能够在精氨酸琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1,ASS1)的参与下自主合成[2]。而在部分实体瘤中，如肝癌、黑色素瘤，肿瘤细胞由于缺乏ASS1基因而不能自主合成精氨酸，必须依赖血液循环中的外来精氨酸才能生存。ADI能将进入肿瘤微环境中的精氨酸直接分解为瓜氨酸，阻断实体瘤的营养来源，故实体瘤对ADI诱发的营养剥夺疗法敏感[3]，这显示出ADI在抗癌方面的广阔潜力。但ADI作为典型的外来蛋白质类抗癌酶，在体内具有极不稳定、明显的免疫原性、靶向能力差、易耐受等缺点，这严重限制了其临床应用[4]。

ADI-PEG20为改良的聚乙二醇化的ADI，目前已经在多种肿瘤中进行了大量单独或联合使用的临床研究，结果表明在肝癌患者中，接受ADI-PEG20协同治疗后患者的中位生存期得到提高[5]。除了进行聚乙二醇化修饰外，还有研究者采用羧甲基壳聚糖来递送ADI，通过纳米粒递送系统提高其稳定性和生物利用度[6]。但是目前尚没有关于ADI脂质纳米递送系统的相关报道。已有研究使用羟丙基-β-环糊精脂质纳米粒封装天冬酰胺酶，以此提高了酶的生物利用度[7]。脂质体是一种常见的拟细胞膜的纳米载体，具有良好的组织相容性，已用来包载尿酸酶和过氧化氢酶[8-9]。TPGS作为各国药监局批准的安全佐剂，在药物递送中常作为抗药物耐药的有效辅料[10]，且有研究表明其具有肝脏靶向性，可更有效递送药物至肝脏[11]。

鉴于此，我们首次制备了新型D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯修饰的载精氨酸脱亚胺酶环糊精脂质纳米粒(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate-modified arginine deiminase cyclodextrin lipid nanoparticles，ACLN)，拟解决ADI应用上的缺点。本文初步考察了ACLN的酶活性特点和体内药代动力学行为，初步得知ACLN在包封ADI后，能够提高ADI的酶活性和生物利用度，这为下一步研究ACLN的静脉给药疗效奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂重组精氨酸脱亚胺酶(来源支原体，规格：10 g·L-1，批号：20170901，重庆艾美迪生物科技有限公司)；羟丙基-β-环糊精(规格：500 g，江苏泰兴新鑫医药辅料有限公司)；Lipoid S 100(规格：25 g，德国Lipoid Gmb H公司)；D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(规格：1 g，大连美仑生物技术有限公司)；L-精氨酸(规格：100 g，美国Sigma)；L-瓜氨酸(规格：25 g，上海维塔化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器UV-2600型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)；SB-1300旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；Zetasizer Nano ZS型粒度仪(英国马尔文公司)；JEM-1400Plus型透射电镜(日本电子株式会社)。

1.3 实验动物SPF级SD大鼠，体质量(220 ± 10)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK(渝)2016-0001。

1.4 制备采用逆相蒸发法制备TPGS修饰脂质体。称取适量的磷脂、胆固醇和TPGS(摩尔比为1 ∶3 ∶1)，加入适量二氯甲烷溶解，避光、45 ℃条件下减压旋转蒸发直至形成均匀薄膜。加入乙醚使薄膜溶解，再加入含多种微量金属离子(Co2+、Ca2+、K+、Na+)的ADI的羟丙基-β-环糊精溶液，冰浴中超声，再次旋转蒸发除去有机溶剂，直至形成均匀的乳白色混悬液，最后通过0.22 μm滤膜即得ACLN。

1.5 酶活性

1.5.1测定方法 采用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法测定ADI酶活性[12]。简单来讲，在酸性高温下，精氨酸水解产物L-瓜氨酸能与二乙酰一肟-氨基硫脲反应显红色。精氨酸溶液置于37 ℃下水浴10 min，加入ADI或ACLN溶液，反应5 min后，混合酸-铁溶液终止反应。加入显色液混匀后在高温下进行显色反应，最后测定紫外吸收值(λ=530 nm)。1个酶活力单位是指特定条件(37 ℃、pH 6.5)下，1 min内能转化1 μmol L-精氨酸所需的ADI的量。

1.5.2线性范围 配制系列L-瓜氨酸标准溶液，浓度分别为0、60、70、80、90、100、110、120、130、140 mg·L-1，按“1.5.1”项下处理后，以浓度为0 mg·L-1的L-瓜氨酸标准溶液为对照，测定其它样品在530 nm处的吸光度值，绘制标准曲线。

1.5.3重复性 配制5份低、中、高(60、100、140 mg·L-1)浓度的L-瓜氨酸标准溶液，按“1.5.1”项下方法测定吸光度值，计算测量值RSD，考察方法的重复性。

1.5.4回收率 配制“1.5.3”项溶液，同法处理后，计算测量值与实际值的比，以考察方法的准确性。

1.5.5最适温度、pH及4℃稳定性 设置系列温度(20-70 ℃)和系列pH(5.0-9.0)的反应体系，按照“1.5.1”的方法分别测定ADI和ACLN的酶活性，取ADI最高活性为100%，计算其他样品的相对活性，取最大相对活力的点为最适温度或pH。将ADI和ACLN放置在4 ℃条件下，按预设的天数取适量样品，同“1.5.1”法计算ADI相对活性，考察稳定性。

1.5.6体外酶动力学 在特定条件下，以0.50、1.00、1.25、2.00、2.50、5.00和10.00 mmol·L-1的精氨酸溶液为底物，按“1.5.1”方法进行，计算L-瓜氨酸的量。以生成的L-瓜氨酸的量除以反应时间计算反应速度V，而L-精氨酸浓度为S，根据Lineweaver-Burk双倒数作图，计算ADI和ACLN的Km、Vmax值。

1.6 体内药代动力学

1.6.1动物分组及处理 取12只♂ SD大鼠称重后，随机分为平均体重相似的两组，按照80 U·kg-1分别尾静脉给予原料药ADI和ACLN，给药前禁食24 h，处理整个过程中不禁水。

1.6.2样品采集与处理方法 在给药后168 h内的各个时间点，眼底静脉丛取血300 μL。标本需进行抗凝处理。5 000 r·min-1离心15 min，取血浆100 μL于-80 ℃保存待用。血浆样本用去离子水稀释后，按“1.5.1”项下方法进行测定，计算酶的活性并绘制时间-酶活性曲线。

1.6.3数据分析 用DAS 2.1.1软件计算主要药代动力学参数。将游离ADI与ACLN的药时曲线下面积AUC(0-168 h)及药峰浓度Cmax进行方差分析，再采用双向单侧t检验、90%置信区间考察，达峰时间Tmax采用非参数统计Wilcoxon检验，评价游离ADI与ACLN相比是否具有生物等效性(α=0.05)。

2 结果

2.1 测定方法学L-瓜氨酸在60-140 mg·L-1浓度范围内时，吸光度值与浓度呈线性相关。线性回归方程为：A = 0.006 2 C-0.043 9，r=0.999。低、中、高浓度的L-瓜氨酸溶液测量结果RSD分别为3.55%、1.55%、1.93%，平均回收率分别为96.2%、101.4%、99.7%。结果表明，该方法重复性、准确性好，符合测定要求。

2.2 酶活性研究

2.2.1ACLN表征 ACLN为圆形或类圆形，ACLN粒径为(201.23 ± 1.09)nm，表面电位为(-16.46 ± 0.48)mV，包封率为(59.39 ± 4.27)%。

2.2.2最适温度、pH及4 ℃稳定性 如Fig 1A，B所示，ADI和ACLN的最适温度均为37 ℃，最适pH均为6.5，而且在最适温度或pH下，ACLN的活性分别为ADI的1.35和1.3倍。如Fig 1C所示，在低温下放置约70 d后，ADI的活性几乎消失，而ACLN酶活性保留了60%左右，表明ACLN在4 ℃条件下放置稳定性明显高于ADI。

Fig 1 Optimum temperature, optimum pH and stability of ADI and ACLN n=3)

2.2.3体外酶学动力学 如Fig 2所示，由Lineweaver-Burk双倒数作图计算得到ADI和ACLN的Km值分别为0.87 mmol·L-1、0.74 mmol·L-1，Vmax值分别为53.28 μmol·L-1·min-1、62.50 μmol·L-1·min-1。ACLN的Km低于ADI酶，Vmax约为ADI的1.17倍。表明ACLN提高了酶与底物的亲和性，提高了ADI酶活性。

Fig 2 Lineweaver-Burk plot of ADI and ACLN n=3)

2.3 药动学评价

2.3.1药动学参数 ACLN和游离酶ADI的活性-时间曲线(Fig 3)中，ADI酶活性下降随时间较快，48 h失活。ACLN直到72 h仍然保留活性，且活性下降较ADI慢，表明了ACLN在体内被消除的速度更慢。DAS 2.1.1软件分析得知，ADI体内代谢过程更符合非房室模型。由主要药动学参数(Tab 1)可知，ACLN的AUC(0-168 h)和MRT(0-168 h)分别是ADI的3.81和2.69倍，ACLN的Tmax和Cmax分别是ADI的3.00和1.59倍，与游离ADI相比，ACLN的相对生物利用度为381.42%，以上结果表明，ACLN能够延长ADI的体内滞留时间，并提高ADI的生物利用度。

Fig 3 Activity-time curves of ADI and ACLN n=6)

Tab 1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters of ADI and ACLN after intravenous administration n=6)

2.3.2生物等效性 由Tab 2可见，ACLN与游离ADI的AUC(0-168 h)和Cmax的90%置信区间均不在生物等效性标准区间范围内，对Tmax进行非参数Wilcoxon检验后发现ACLN与游离ADI的Tmax差异具有统计学意义(P<0.05)，故而可以判定，ACLN与游离ADI不具有生物等效性，ACLN的体内生物利用度和药效学标准更高。

Tab 2 Bioequivalence comparison of ACLN and free ADI after intravenous administration n=6)

3 讨论

ADI是一种高效、低毒的抗肿瘤蛋白类药物，为精氨酸的专一水解酶。ADI可以消耗掉癌症病灶中的精氨酸，进而诱发线粒体功能障碍、过度自噬、核DNA泄漏，最终导致癌细胞死亡[13]。ADI承担的精氨酸剥夺疗法能够在多种肿瘤上发挥抗癌作用。本研究首次使用TPGS修饰的环糊精脂质体用来包载ADI，初步考察了ACLN的酶活性特点和体内药动学行为。

本实验中采用二乙酰一肟-氨基硫脲比色法测定ADI酶活性，方法可靠。与ADI相比，在最适温度或pH下，ACLN的酶活性提高了约1.35和1.3倍，此外，ACLN的米氏常数低于ADI，说明ACLN对酶的亲和性高于ADI。表明了TPGS修饰的环糊精脂质体包载ADI后，能够提高ADI的酶活性。影响酶活性的因素有很多，比如超声作用、溶液环境、基团互作等，导致蛋白结构域变构进而使酶活性中心受到影响[11]。ACLN是一种拥有环糊精中空结构的纳米粒，包载ADI后并不影响酶的最佳反应条件(温度和pH)，但是在同等条件下表现出更高的酶活性，可能的原因在于：① 羟丙基-β-环糊精的疏水端与二聚体的酶的部分结构域相互作用，使得酶与环糊精组成一个复杂的超分子共和物，使得酶活性中心更暴露，与底物亲和性增强[14]；② 脂质体的双分子层结构仿如质膜隔室，能够将ADI-环糊精复合物约束在磷脂层类，而小分子量的精氨酸和催化产物瓜氨酸是不受限制的自由进出的，这种微型反应器能够为ADI提供一个狭小独立的反应空间，使得底物与ADI接触的机会更大，这也是酶活性提高的可能原因。

在体内药动学研究中，ACLN的生物利用度为ADI的3.81倍。表明将ADI包载与ACLN中，可以明显提高药物的生物利用度。可能原因如下：① 脂质体具有缓释、良好的生物相容性等特点，能够限制ADI的释放，并阻止体内复杂环境对酶结构的直接破坏，从而延长的药物的作用时间[8]；② ACLN纳米粒与酶相互作用，维持酶活性中心结构，增强其应对环境变化的能力，提高稳定性；③ TPGS是一种天然的P-gp抑制剂，能够限制细胞将药物从胞内转至胞外，从而增加药物在组织细胞中的滞留时间；④ 双亲性的TPGS可以加强对酶的包封，提高酶在机体内的稳定性[15]。综上所述，本实验制备的TPGS修饰环糊精脂质体提高了ADI的酶活性和生物利用度。另外，TPGS修饰脂质体具有肝脏靶向作用[11]，因此可以进一步研究ACLN在肝癌细胞和动物模型上的靶向抗癌作用。

(致谢：本文实验在重庆医科大学药学院高校药物工程研究中心完成，特此致谢！)