冷榨菜籽蛋白的碱性电解水提取工艺及其结构性能表征

杨万富，黄桃翠，刘和平，张祖清，Waleed A.S. Aldamarany，高羽歌，钟 耕※

（1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715； 2. 重庆市农业科学院水稻研究所，重庆 400060；3. 重庆市凯欣粮油有限公司，重庆 401121）

0 引 言

菜籽饼是油菜籽榨取油脂的副产物，中国近几年菜籽饼年产750 万t 以上，通常用于动物饲料和农业肥料，经济效益低，而冷榨菜籽饼蛋白质（质量分数35%～40%）因压榨条件相对温和，是开发高附加值产品[1-3]的优质资源。菜籽蛋白含有丰富的甲硫氨酸和半胱氨酸[4]，具有平衡的氨基酸组成[5]、良好的乳化、起泡、凝胶等功能特性[6-8]和较高的营养价值。目前菜籽蛋白的提取方法主要包括pH 分段控制法（碱、酸、盐）结合超声、微波、膜分离、纳滤等手段和其他方法（奥斯本-门德尔分离法、醇溶液提取、反胶束、酶解和微生物发酵等）[9]。

为满足工业化大规模生产要求，pH 分段控制法是提取分离植物蛋白的主要方法，该法使用大量的强酸/碱调节提取液pH 值，产品提取率低、色泽及溶解性差、能耗高且提取蛋白产生的废水、废渣不易处理，对环境不友好[9-10]。碱性电解水是酸性电解水的副产品，为小分子团簇结构，表面张力较低、渗透性较强，可以作为较好的溶剂，且易逐渐恢复为普通水[11]，对环境无污染，采用不同电解质可以制得pH 值达12 以上的碱性电解水。此外， 碱性电解水具有一定的氧化还原电位（Oxidation-Reduction Potential, ORP），其可以保护蛋白质的活性基团免受氧化，并提高最终产品的质量[11-12]。Toge 等[13]利用碱性电解水提取鱼油，其提取率较Bligh-dyer 法高。苗雨欣等[14]用pH 值12.5 碱性电解水提取灵芝多糖与传统水提法相比，灵芝多糖得率提高了74.72%。李志豪等[15]用pH 值为8.5～10 的碱性电解水提取籽瓜种仁蛋白，其提取率比传统的碱溶酸沉法高1.7～8.3 个百分点。谭晓妍等[16]采用碱性电解水耦合酶提取茶渣蛋白，不仅提高了茶渣蛋白的提取率，而且提高了蛋白质抗氧化能力。Li 等[17]研究表明超声辅助碱性电解水提取南极磷虾蛋白质可以减少30.9%（质量分数）氢氧化钠消耗量，同时保护了羰基、游离巯基等活性基团。

碱性电解水制作简单，与生产传统化学试剂相比成本低廉，且具有碱性特质和高渗透性，较NaOH 使用安全可靠[16]。因此本试验以冷榨双低菜籽饼为研究对象，对碱性电解水提取冷榨菜籽饼蛋白（简称菜籽蛋白）工艺进行优化研究。考察了碱性电解水pH 值、料液比、提取温度和时间等因素对菜籽蛋白提取率的影响，通过响应面法优化菜籽蛋白的提取工艺；并对比分析了相同条件下传统酸/碱法调配pH 水（Ultrapure water extracted Rapeseed Protein，URP）与碱性电解水（Alkaline electrolyzed water extracted Rapeseed Protein，ARP）对菜籽蛋白提取率、结构和功能特性方面的影响。目前利用ORP 值和高pH 值电解水提取油料饼粕蛋白的研究还未见报道，本研究对菜籽蛋白的高效绿色提取和应用提供技术支持，可促进油料蛋白资源的开发利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

双低油菜籽：重庆市红蜻蜓油脂有限公司提供，经冷榨机（东都宝电器科技有限公司，D02，浙江温州）榨油得冷榨菜籽饼，其基本成分见表1，符合国家双低菜籽饼标准（NY/T 417-2000）。冷榨菜籽饼于室温1:10 (g/mL)石油醚脱脂12 h，通风干燥，直到没有明显的石油醚气味，粉碎并过60 目筛。

表1 冷榨菜籽饼基本成分含量Table 1 The components content of cold presed rapeseed meal

牛血清白蛋白、芥酸、植酸均为标准品，美国Sigma公司；考马斯亮蓝G-250、磷酸盐、溴酚蓝等试剂均为分析纯，重庆市钛新化工有限公司。

1.2 仪器与设备

多功能富氢水制备器，广东新康公司；Sartorius pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；5840R 冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；SY-10 真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；759 系列紫外可见光分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；L8900-全自动氨基酸分析仪、F-2500 荧光分光光度计，日本日立公司；CM-5分光测色仪，日本KonicaMinolta 公司；Spectrum100 红外光谱仪，珀金埃尔默公司；NanoZS90 纳米粒度及Zeta电位分析仪，英国马尔文公司。

1.3 方 法

1.3.1 碱性电解水的制备

碱性电解水由广东新康科技有限公司XK-A7 电解水生成器制备得到，其中pH 值为 8.5、9.5、10.5 电解水由电解水生成器电解自来水不同时间所得；pH 值11.5 和12.5 电解水为电解饱和氯化钠溶液一定时间所得。每隔一定时间取少量电解水用pH 计测定其pH 值，待其达到所需pH 值的碱性电解水即可，电解水可放置一年时间，pH 值保持不变。

1.3.2 冷榨菜籽饼基本成分的测定

冷榨菜籽饼中粗蛋白含量、水分含量均参照食品安全国家标准进行测定[18-19]。硫代葡萄糖苷测定参照吴谋成等[20]方法。芥酸测定参照李笑笑等[21]方法。植酸测定参照Zhang 等[22]方法。

1.3.3 冷榨菜籽蛋白制备及提取率的计算

准确称取脱脂冷榨菜籽饼粉20.0 g，与一定比例的碱性电解水混合，在一定温度下水浴锅中磁力搅拌提取一定时间，提取液离心10 min（4 ℃、5 000 r/min），取上清液，用HCl（1.0 mol/L）溶液调pH 值至4.5，离心10 min（4 ℃、8 000 r/min），收集沉淀，水洗至中性，−80 ℃预冻12 h，经真空冷冻干燥得粉状物，冷藏（4 ℃）备用。

对照组分离蛋白采用传统碱溶酸沉法制备：准确称取20.0 g 粉碎脱脂粉，与一定比例的碱水（用1.0 moL/L NaOH 调节纯水至相应pH 值）混合，其余操作与碱性电解水提取相同。

参考Zhang 等[22]的方法利用Bradford 法测定上清液蛋白质含量。标准曲线为：y=6.890 5x+0.018 8（R2=0.998 7）x为蛋白质质量浓度mg/mL；y为595 nm 处吸光度。

菜籽蛋白提取率按下式计算：

式中C为上清液蛋白含量，mg/mL；V为上清液体积，mL；m为脱脂粉蛋白质量，g。

1.3.4 菜籽蛋白提取工艺优化

分别研究料液比（1:7～1:12 g/mL）、pH 值（8.5～12.5）、提取温度（20～60 ℃）和提取时间（20～80 min）4 个因素对菜籽蛋白提取率的影响，其中以料液比1:10 g/mL、碱性电解水pH 值9.5、提取温度20 ℃、提取时间60 min 为固定水平因素。

采用JMP Trial 16 软件，参考单因素试验结果，根据Box-Bhenken 原则进行试验设计，以料液比、碱性电解水pH 值、提取温度、提取时间为考察因素，菜籽蛋白提取率（Y）为评价指标，试验设计如表2 所示。

表2 Box-Behnken 试验设计与水平设定Table 2 Experimental factor and levels setting of Box-Behnken design

1.3.5 菜籽蛋白成分测定

氨基酸组成参照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》方法测定。

蛋白质分子质量采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，参考Li 等[23]的方法并略作修改如下：采用质量分数4%浓缩胶和12%分离胶。吸取20μL 蛋白样品（5 mg/mL）与5μL 样品缓冲液混合，煮沸5 min，冷却后分别加入到胶孔。恒压80 V 电泳30 min，待进入分离胶后采用120 V 电泳至溴酚蓝跑到分离胶底部。电泳结束后剥胶并水洗3 次，用溶于甲醇∶乙酸∶水（5∶1∶4，v/v/v）的0.12 g/mL 考马斯亮蓝R-250 浸泡过夜，最后与脱色剂（甲醇∶乙酸∶水=5∶1∶4，v/v/v）混合，脱去背景色至条带清晰。

1.3.6 菜籽蛋白理化特性测定

色泽采用CM-5 分光测色仪测定，由L*、a*、b*的值量化。

参考Chen 等[24]的方法略作修改，测定菜籽蛋白表面疏水性。取适量菜籽蛋白于离心管，用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer，PBS，0.01 mol/L，pH=7.0）配制2 mg/mL 蛋白溶液，再吸取0.5 mL 1 mg/mL 溴酚蓝溶液（Bromophenol Blue，BPB）与之混合。同时制备对照组样品，5 mL PBS 和0.5 mL BPB。所有样品旋涡5 min 后离心10 min（4 ℃，8 000 r/min)。取0.5 mL 上清液和5 mL PBS 混匀，于595 nm 处测定吸光值。

巯基和二硫键含量参考Li 等[17]的方法略作修改。测定总巯基含量时，用含8 mol/L 尿素Tris-Gly 缓冲液配制3 mg/mL 蛋白溶液，加入60μL 4 mg/mL 2-硝基苯甲酸（5,5-Dithiobis-2-nitrobenzoicaci，DTNB），室温下反应1 h后离心15 min（5 000 r/min），取上清液在412 nm 处测定吸光值，以含60μL DTNB 溶液和Tris-Gly 溶液为空白对照。测定游离巯基时用不含尿素Tris-Gly 缓冲液配制3 mg/mL 蛋白溶液其余操作与测定总巯基含量相同。

粒径参照Li 等[23]的方法测定，水折射率1.330，材料折射率1.450。

Zeta 电位参照Crudden 等[25]的方法测定。用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH=7.0）配制1 mg/mL 蛋白溶液，取0.9 mL 蛋白溶液室温下用粒度仪测定。

1.3.7 菜籽蛋白结构测定

采用Spectrum 100 傅里叶红外光谱分析蛋白质结构，扫描范围400～4 000 cm-1，扫描次数64 次。

内源荧光参考Jiang 等[26]的方法测定，用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH=7.0）配制0.1 mg/mL 蛋白溶液，使用5 nm 狭缝在激发波长295 nm 下记录300～400 nm 发射光谱。

1.3.8 菜籽蛋白功能特性测定

参照Purkayastha 等[27]的方法测定菜籽蛋白溶解度（Solubility, S），持水性（Water Absorption Activity, WA），持油性（Fat Absorption Activity, FA），乳化性（Emulsifying Activity, EA），乳化稳定性（Emulsifying Stability, ES），起泡性（Foaming Capacity, FC）和起泡稳定性（Foaming Stability, FS）。

1.4 数据处理

试验结果均以平均值±标准差表示，采用 Orign 2021 pro 软件作图和单因素中的Tukey 检验进行显著性分析（P＜0.05 表示显著），JMP Trial 16 软件进行回归分析和t检验。

2 结果与分析

2.1 菜籽蛋白提取单因素试验结果

由图1a 可知，菜籽蛋白提取率在料液比1:10 g/mL时取得最大值，当料液比小于1:10 g/mL 时，菜籽蛋白提取率随料液比增加而显著提高，这是由于随着料液比增大，体系黏度降低，物料与介质充分接触，均匀分散在水相中，促进蛋白质转移[28]。当料液比大于1∶10 g/mL时，菜籽蛋白提取率略有降低，可能为体系中游离油脂与部分蛋白乳化所致[29]。因此，选用料液比1∶9～1∶11 g/mL 作为后续工艺优化。

由图1b 可知，随碱性电解水pH 值增大菜籽蛋白提取率呈先增大后降低趋势，当pH 值≥12 会引起蛋白质变性和赖-丙氨酸复合物形成[28]，降低营养价值；且多酚易氧化成醌类物质与蛋白质的氨基和游离巯基发生加成反应[30]，使菜籽蛋白提取液颜色变为黄绿色、绿褐色[31]。因此选择pH 值为9.5～11.5 碱性电解水进行后续工艺优化。

由图1c 可知，菜籽蛋白提取率随提取时间延长而增大，20 到40 min 内蛋白提取率迅速增加，50 min 时达到最大值，其后提取率无明显变化，这可能是可溶性蛋白已基本完全溶解达到传质平衡。因此，从降低能耗和产量考虑，选择40～60 min 进行后续工艺优化。

由图1d 可知，菜籽蛋白提取率随温度增加呈先增大后降低的趋势，在40 ℃时达到最大值。这是由于在一定温度范围内，随着温度升高可以降低体系黏度从而加快分子运动，增加蛋白溶解度[32]，因此选择30～50 ℃进行后续工艺优化。

2.2 响应面工艺优化与结果分析

2.2.1 Box-Behnken 试验结果与方差分析

根据Box-Behnken 原则按照表2 因素和水平建立4因素3 水平试验设计，详细试验方案及结果见表3。对表3 中菜籽蛋白提取率（Y，%）和4 因素运用JMP Trail16 软件进行二次多元回归拟合得到菜籽蛋白提取率的回归方程为

表3 Box-Behnken 试验设计与结果Table 3 The experimental de-results of Box-Behnken

2.2.2 回归模型分析

通过t检验对模型系数进行显著性检验，结果如表4所示。由表可得，一次项（A、B、C、D）、二次项（A2、B2、C2、D2）和交互项BC、AD、BD的P值均<0.05，表明各变量系数对模型影响显著。回归模型系数绝对值大小可以看出，各因素对蛋白提取率的影响程度由大到小为：B>A>C>BC>D>AD，即碱性电解水pH 值、温度、料液比、碱性电解水pH 值与料液比、时间、温度与时间。

2.2.3 回归模型方差分析和失拟项性检验

对回归模型进行F检验和方差分析，结果如表5 所示。由表可得，模型P值<0.000 1 和失拟项P值>0.05，且回归模型调整决定系数R2=0.93，表明该回归模型在试验范围内能较好地预测和优化碱性电解水提取冷榨菜籽蛋白工艺。

表5 模型方差分析及失拟项检验Table 5 Model variance analysis and lack of fit test

2.2.4 工艺优化与验证

利用JMP 软件对碱性电解水提取冷榨菜籽蛋白工艺参数优化，当提取温度45.23 ℃、pH 值11.5、液料比1∶9.727 g/mL、提取时间60 min，此时理论提取率为59.79%。考虑到实际操作，调整为温度45℃、pH 值11.5、料液比1:10 g/mL 和提取时间60 min，并在此条件进行验证试验和对比试验，结果如表6 所示，碱性电解水的蛋白提取率为59.34%与预测值相差不大，表明该模型可用于预测和分析碱性电解水提取冷榨菜籽蛋白工艺。由对比试验可知，ARP 提取率比URP 高8.62 个百分点，这是由于碱性电解水具有小分子团簇结构，表面张力低，渗透性强，且含有较多OH-促进H+脱离碳原子和硫酸盐基团以及氢键断裂[15]，增加了蛋白质表面电荷数，增强了蛋白质间静电斥力和水合作用[17]，使溶解度增加。与URP相比，每处理1 kg 菜籽饼，可减少1.28 g NaoH 用量。Li[17]等研究表明超声辅助碱性电解水提取南极磷虾蛋白质可以减少30.9%氢氧化钠消耗量。Watanbe 等[33]在不添加酸或碱情况下，通过电解不同电解质来调节溶液pH值，不仅提高了米糠蛋白提取率，而且还减少了蛋白脱盐。且因其活性成分不稳定，易与光、空气及有机物等接触逐步放电分解，其ORP 值逐渐下降并趋于正常，还原为普通的水[16]。因而较NaOH 使用安全可靠。

表6 电解水与纯水提取冷榨菜籽蛋白试验对比Table 6 Comparison of the experiment between ARP and URP of extraction rapeseed protein

2.3 不同提取方法对菜籽蛋白理化性质影响

2.3.1 不同提取方法对菜籽蛋白色泽的影响

使用色差仪CM-5 测定菜籽蛋白色泽，结果如表7所示，碱性电解水对菜籽蛋白的L*，a*和b*值均有显著作用（P<0.05）。结果表明碱性电解水能增加菜籽蛋白的亮度，降低红色偏向和黄色偏向，使蛋白色泽更浅。

表7 不同提取方法对菜籽蛋白色泽的影响Table 7 Effects of extraction method on the colour of rapeseed protein

2.3.2 不同提取方法对菜籽蛋白组成的影响

据报道，菜籽蛋白主要包含12S 球蛋白（44.3～66.4 kDa），球蛋白由α-肽链（30.0～40.0 kDa）和β-多肽（20.0 kDa）链，以及1.7/2S 白蛋白（约为14 kDa）。由图2 可知，ARP 与URP 分子量分布集中在14、20～30、32～66.4 kDa 之间，两者分子量无显著差异；其中ARP蛋白质条带较URP 蛋白质条带明显，这是由于蛋白质在高碱性提取条件下发生水解[23]。

由表8 可知，ARP 纯度比URP 高，且天冬氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、疏水性氨基酸和酸性氨基酸含量显著高于URP（P<0.05），谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和碱性氨基酸含量显著小于URP（P<0.05）。另外ARP 中半胱氨酸和甲硫氨酸含量显著高于URP（P<0.05），这可能是因为半胱氨酸是对氧化修饰最敏感的氨基酸，且二硫键在多肽链半胱氨酸之间形成[34]。

表8 菜籽蛋白氨基酸组成分析Table 8 Analysis of the amino acid composition of rapeseed protein

2.3.3 不同提取方法对菜籽蛋白理化特性的影响

ARP 法疏水性为(50.92±2.3)μg 显著大于URP 法疏水性(40.70±2.33)μg（P<0.05），这与李志豪等[15]研究结果一致，这可能是电解水中离子之间通过静电屏蔽效应，使胶体颗粒表面电势降低而非极性基团疏水作用增强[35]。

ARP 法总巯基含量和游离巯基含量分别为22.64 和16.88μmol/g 均显著大于URP 法的20.43 和15.00μmol/g（P<0.05），且ARP 法中的二硫键含量2.88μmol/g 略高于URP 法2.72μmol/g，这与表8 中ARP 法半胱氨酸含量显著大于URP 法结果一致。

由图3 可知，ARP 颗粒大小分布在8.72～15.70 和91.30～396.00 nm 之间；URP 颗粒大小分布在11.70～18.20 和122.00～459.00 nm 之间。结果表明ARP 粒径比URP 小，能够促进蛋白质与脂质之间相互作用[15]，增加其乳化性。这可能是提取过程中添加的碱液使菜籽蛋白肽链裂解，导致菜籽蛋白分子结构展开，暴露出的疏水基团之间的相互作用加强[20]，且URP 疏水性小于ARP，URP 更易形成可溶性聚集体，导致粒径增大。

蛋白质是一种含有极性基团和非极性基团的两性电解质，极性基团在溶液中暴露出出来，使蛋白质表面带电，ζ电位可以很好表征蛋白质溶液性质。在中性磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH=7.0）中ζ均为负值，这表明菜籽蛋白负电荷氨基酸大余正电荷氨基酸，且ARPζ绝对值11.90 mV 显著大于URPζ绝对值10.17 mV（P<0.05）。

2.3.4 不同提取方法对菜籽蛋白结构的影响

蛋白质二级结构常用酰胺I 带（1 600～1 700 cm-1）来反映，其中α-螺旋和β-折叠为有序结构，β-转角和无规则卷曲为无序结构。由表9 可得，与URP 二级结构相比，ARP 中β-折叠相对含量增加，α-螺旋、β-转角和无规则卷曲降低，且ARP 中α-螺旋和β-折叠之和显著大于URP，这表明ARP 结构更加有序。

表9 不同提取方法对菜籽蛋白二级结构的影响Table 9 Effects of extraction methods on the secondary structure of rapeseed protein

荧光光谱法可以探测蛋白质中色氨酸残基的微环境变化，并可以用于研究蛋白质三级结构（折叠、解折叠和聚集）变化[36]。荧光强度或发射波长最大值变化表明色氨酸残基微环境变化。由图4 可知，URP 与ARP 荧光光谱形状无变化，而ARP 荧光强度大于URP，这表明菜籽蛋白构象发生了变化，碱性电解水可以引起菜籽蛋白去折叠，暴露出更多疏水基团，这与ARP 疏水性大于URP结果一致。

2.3.5 不同提取方法对菜籽蛋白功能特性的影响

由图5a 可知ARP 溶解度38.40%显著大于URP 30.62%（P<0.05），这是因为蛋白质在强离子强度条件下三级结构容易变得松散和拉伸，从而提高了溶解度[37]。持水性和持油性可以增强食品特性和口感，由5b 可知ARP 持油性2.41 g/g 显著大于URP 持油性1.86 g/g（P<0.05），而ARP 持水性0.92 g/g 显著小于URP 持水性1.12 g/g（P<0.05），这是因为ARP 表面疏水性强，且ARP 二硫键多，截留水分能力下降，导致水合能力下降。乳化性主要依赖于蛋白质分子在油水界面的扩散，由图5c 可得ARP 乳化性（35.13 m2/g）略大于URP（32.92 m2/g），而其乳化稳定性19.84 min 显著小于URP 30.81 min（P<0.05），这与李志豪[15]等研究结果一致，这是因为电解质促使菜籽蛋白肽链在提取过程中断裂，溶解度提高，且可溶性蛋白粒径小，表面积大，促进了蛋白质与脂质之间相互作用[20]。由图5d 可知，ARP 起泡性52.92%显著大于URP 47.17%（P<0.05），而其泡沫稳定性53.09%小于URP 64.50%（P<0.05），这是由于ARP游离巯基多，表面疏水性强，且疏水性氨基酸含量多，导致疏水相互作用增强[15]。

3 结 论

1）在单因素基础上，通过四因素三水平JMP-Box-Behnken 试验设计得到碱性电解水对冷榨菜籽蛋白提取优化工艺为：温度45 ℃、pH 值11.5、料液比1:10 g/mL 和提取时间60 min，提取率为59.34%。

2）在优化条件下，碱性电解水提取冷榨菜籽饼分离蛋白（Alkaline electrolyzed water extracted Rapeseed Protein，ARP）提取率比碱溶酸沉法提取菜籽分离蛋白（Ultrapure water extracted Rapeseed Protein，URP）高8.62 个百分点，且纯度高；溶解性、持油性、乳化性和起泡性均显著高于URP（P<0.05），同时ARP 粒径分布范围小，表面疏水性、ζ电位绝对值、游离巯基和二硫键含量均高于URP，二级结构更有序。此外碱性电解水制备简单，成本低廉，在提取过程可减少酸碱液用量，对环境友好。