夹带剂对超临界萃取技术处理肌腱的影响△

骆井万，胡 凯，，李 淼，，汪晶晶，，李 矛，陈维明，，白玉龙，*，陈金发

（1常州市亘从生物力学研究中心，江苏常州213003；2上海亚朋生物技术有限公司，上海201201；3首都医科大学附属北京同仁医院，北京100730）

临床上肌腱和韧带损伤非常常见，尤其是在高危人群亚群中，如新兵、娱乐和精英跑步者以及职业运动员［1，2］。运动医学科和手外科对肌腱移植材料的需求最大［3］。目前肌腱移植材料主要分为自体肌腱、同种异体肌腱、组织工程肌腱以及人工肌腱等［4］。自体肌腱被认为是肌腱大面积缺损移植的金标准。自体肌腱移植虽排斥反应较小，但因其来源有限且有创，无法满足临床需要［5，6］。同种异体肌腱移植可以避免上述缺点，实现肌腱较好的愈合，但由于免疫原性以及疾病传播风险等因素导致其使用受到阻碍［7］。肌腱的抗原性主要源自细胞、血液等成分，因此组织清洁和脱细胞是减轻抗原性的必要措施。本研究采用添加不同夹带剂的超临界萃取技术（supercritical CO2fluid extraction,SCCO2）对同种异体肌腱进行一步法脱细胞处理，以期在不损害其生物力学性能的情况下有效的缩短处理时间，制备生物相容性良好和脱细胞化的同种异体肌腱。

1 资料与方法

1.1 材料制备

将肌腱原料去除肌肉等软组织后纯化水漂洗三遍，-80℃冰箱保存备用。上述肌腱材料由上海亚朋生物技术有限公司提供，常规作血型检查，各型肝炎病毒、HIV病毒等传染性疾病的检测合格。

超临界萃取条件：同种异体肌腱室温下解冻，包装于特卫强袋中，装载到压力容器中，在37°C和35 MP下，分别加入以下不同夹带剂后，保温保压2 h，再萃取2 h。在30 min内缓慢减压，取出肌腱并进行两层密封备用。

A组：-80℃备用肌腱，未经处理；B组：SCCO2处理，且夹带剂为无水乙醇；C组：SCCO2处理，且夹带剂为无水乙醇+1%乙二胺四乙酸；D组：SCCO2处理，且夹带剂为环氧乙烷/环氧丙烷共聚醚二醇（ethylene oxide/propylene oxide polyether glycol,EO/PO）。

1.2 力学性能测试

采用万能材料试验机（型号CTM8010，上海协强仪器制造有限公司），作匀速单轴加载试验，速度20 mm/min。同种异体肌腱两端2 cm处用湿润的纱布包裹，增加力学机夹具的摩擦力，对样品进行拉伸直至断裂，每组样品重复测量数量为5根。

1.3 组织学观察

同种异体肌腱15 min复水之后，经10%甲醛固定24 h以上，脱水、透明、石蜡包埋，肌腱纵切面切片，随机取三个不同的层面进行切片，按常规方法进行苏木精-伊红染色，光学显微镜400倍视下进行形态学观察。

1.4 体外细胞增殖测试

将两层密封的A-D组的同种异体肌腱，放于紫外下照射30 min后备用。

将1×105个/ml小鼠成纤维细胞L929细胞悬液以每孔100 μl接种于96孔板中，并在细胞培养箱（37℃，5% CO2，＞90%湿度）中培养，待细胞贴壁生长至80%左右，弃去96孔板内原培养基，在96孔板相应孔内各加入100 μl 100%同种异体肌腱浸提液（A-D组）和阳性组（5% DMSO），以及阴性组（不加任何样品）。每组设置6个复孔。培养24 h后取出96孔板，在显微镜下观察细胞形态，然后去除液体，每孔加入50 μl MTT（终浓度为1 mg/ml），置恒温培养箱中培养。2小时后去除上清，每孔加入100 μl异丙醇溶解结晶，在酶标仪上测定570 nm波长下的吸光度值，计算其细胞毒性。

1.5 统计学方法

使用SPSS 8.5软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体外观

经SCCO2处理的同种异体肌腱表现出明显的干燥脱水现象，且较为坚硬，不易形变，浸泡在纯化水中至少15分钟后，肌腱才恢复典型的白色或浅黄色和光泽纹理，且较为柔软。

2.2 力学性能

四组肌腱力学检测结果见表1。四组同种异体肌腱的最大载荷差异无统计学意义（P＞0.05）；与A组相比，D组的抗拉强度变小（P＞0.05），且弹性模量显著变小以及断裂伸长率显著增大（P＜0.05）。D组的抗拉强度小于B组和C组，但差异无统计学意义（P＞0.05），D组的弹性模量小于 B组和 C组（P＞0.05），但断裂伸长率显著大于B组和C组（P＜0.05）。

表1 四组同种异体肌腱的力学测试结果（±s）与比较

表1 四组同种异体肌腱的力学测试结果（±s）与比较

*，#表示与D组相比差异有统计学意义（P＜0.05）

images/BZ_58_240_416_558_483.png最大载荷（N）弹性模量（MPa）images/BZ_58_558_416_902_483.png736.12±66.49 448.79±146.92*images/BZ_58_902_416_1278_483.png894.51±159.09 431.53±114.93images/BZ_58_1278_416_1663_483.png777.05±146.17 439.45±118.86images/BZ_58_1663_416_2028_483.png755.75±60.04 284.84±78.19images/BZ_58_2028_416_2311_483.pngimages/BZ_58_240_549_558_615.pngimages/BZ_58_558_549_902_615.pngimages/BZ_58_902_549_1278_615.pngimages/BZ_58_240_682_558_748.pngimages/BZ_58_558_682_902_748.pngimages/BZ_58_1278_549_1663_615.pngimages/BZ_58_1663_549_2028_615.pngimages/BZ_58_2028_549_2311_615.pngimages/BZ_58_902_682_1278_748.pngimages/BZ_58_1278_682_1663_748.pngimages/BZ_58_1663_682_2028_748.pngimages/BZ_58_2028_682_2311_748.png0.179 0.127

2.3 组织形态学

四组肌腱组织切片HE染色结果见图1。可见未经处理的同种异体肌腱（A组）具有明显的肌腱细胞存在，细胞结构细长且沿着肌腱纤维纵向排列分布。而添加无水乙醇、无水乙醇+1%EDTA的SCCO2技术处理的同种异体肌腱（B组，C组）具有少量的细胞存在，并不能达到完全脱细胞效果。添加EO/PO的SCCO2处理的同种异体肌腱（D组）则无细胞和细胞核存在，只有细胞外基质结构，表明此方法能有效的脱细胞。同时所有经SCCO2处理的同种异体肌腱纤维组织排列整齐且未被破坏。

图1 各组肌腱组织学观察（HE，×400） 1a:A组（单纯冷冻），可见大量细胞 1b:B组（无水乙醇SCCO2处理），组织结构完整，但细胞成份显著减少 1c:C组（EDTA-SCCO2处理），组织结构完整，细胞成份明显减少 1d:D组（EO/PO-SCCO2处理），组织结构完整，细胞消失

2.4 体外细胞增殖试验

体外细胞增殖试验结果见图2，L929细胞在A组和经SCCO2处理的同种异体肌腱B-D组条件中，24 h的细胞增殖吸光度值分别为（0.88±0.12）、（0.87±0.08）、（0.92±0.15）和（0.92±0.12），与阴性对照组（1.00±0.19）的差异无统计学意义（P＞0.05），而与阳性对照组（0.32±0.10）的差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 同种异体肌腱24 h细胞增殖情况图

3 讨论

限制同种异体肌腱应用主要有两方面因素:（1）肌腱本身的免疫原性；（2）经处理后肌腱的强度变化。本质上说肌腱在体内就是起到力量传递作用，所以肌腱本身必须保持一定的抗拉伸强度及韧度，否则将直接导致手术的失败［8，9］。同时脱细胞化是软组织移植制造中的关键步骤。目前使用的物理（如反复冻融）和化学处理技术（如十二烷基硫酸钠）对同种异体肌腱生物力学性能的有害影响已经引起了人们的关注，这可能导致临床性能不佳和移植失败［10］。

最近的研究显示，超临界二氧化碳是一种可替代传统灭菌方式的温和灭菌方法，在超临界状态下，CO2具有低粘度和零表面张力的特点，具有穿透复杂结构和多孔材料的能力［11］。低表面张力促进CO2渗透到生物材料中，这使得材料在结构和物理化学性质保持完整的情况下并达到高效灭菌的效果［12，13］。另外由于SCCO2对非极性和极性分子的溶解能力体现在生物材料中各种活性成分的浸渍过程中，从组织中去除细胞成分而获得细胞外基质，因此超临界二氧化碳具有很好的脱脂效果［14］。使用合适的夹带剂可以提高超临界二氧化碳浸润和萃取效果以及脱细胞效果，研究中发现B组，C组可见少量细胞核，D组未观察到细胞核和细胞残余现象，只观察到红色的细胞外基质，表明此方法获得了理想的脱细胞材料。从脱细胞作用机理来看，无水乙醇作为一种有机溶剂，使得细胞脱水、溶解和去除脂质而裂解［15］，EDTA是一种能与Mg、Ca等二价金属离子结合的螯合剂。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要这些二价金属，因此通过破坏酶类活动达到降低细胞对细胞外基质的黏附［16］。EO/PO是一种醚类非离子表面活性剂且具有良好的生物相容性，通过破坏DNA-蛋白、脂质和脂质蛋白的相互作用来脱细胞［10，17］，使组织或器官中的蛋白质在经过非离子型表面活性剂处理后仍留有功能性的构象。相比于无水乙醇和EDTA，EO/PO对肌腱的渗透和溶解细胞能力更强，更容易达到脱细胞的效果。同时进一步验证基于SCCO2处理的肌腱的细胞毒性，通过细胞毒性测试结果表明经SCCO2处理的同种异体肌腱与阴性组无显著性差异（P＜0.05），表明该方法不会导致细胞毒性，有利于细胞增殖与生长。

肌腱移植材料最重要的是要具备良好的生物力学性能，以降低手术失败率［3，18］。与A组肌腱相比，在使用不同夹带剂的SCCO2处理的同种异体肌腱在最大载荷和抗拉强度均无显著性差异，这一定程度上证实了SCCO2脱细胞方法能够保持肌腱的机械完整性。这一发现与之前关于SCCO2处理的肌腱和胶原软组织的研究结果一致［19］，从HE染色结果可以看出不同夹带剂SCCO2处理的同种异体肌腱纤维组织排列整齐无断裂，从而最大程度地保留了超微结构和生物力学特性。这从侧面印证了SCCO2处理方法对肌腱的最大载荷和抗拉强度无影响，但添加EO/PO的SCCO2处理的同种异体肌腱，弹性模量显著变小以及断裂伸长率有明显的增大。可能是无水乙醇使得胶原蛋白变性的作用导致肌腱硬度增加。而EO/PO则破坏脂质和脂质蛋白的连接从而降低肌腱的硬度，同时断裂伸长率有所提高。

综上所述，使用不同夹带剂（无水乙醇，无水乙醇+1%EDTA，EO/PO）的SCCO2处理的同种异体肌腱，在保留了原有的肌腱纤维和良好的生物力学性能的同时，通过达到了有效的脱细胞效果，有利于降低其免疫原性且具有良好的生物相容性。SCCO2是一种相对较好的肌腱制备方法，为同种异体肌腱制备的进一步研究奠定理论基础。