不同产地红景天破壁饮片、破壁粉体和传统饮片HPLC 指纹图谱相关性研究

2021-03-10方碧烟甘均龙史军杰彭丽华陈炜璇成金乐

现代中药研究与实践 2021年1期

方碧烟，甘均龙，史军杰，彭丽华，陈炜璇，成金乐*

（1. 广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，广东广州 510006；2. 国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室，中山市中智药业集团有限公司，广东中山 528437；3. 岭南中药资源教育部重点实验室（广州中医药大学），广东广州 510006； 4. 国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东广州 510006）

红景天为景天科植物大花红景天Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba 的干燥根和根茎，可益气活血、通脉平喘，主治气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫、倦怠气喘等症[1]。现代药理学研究表明，红景天及其有效成分红景天苷具有抗疲劳、抗抑郁、增强免疫力、清除活性氧自由基、抗肿瘤、护肝等作用，对神经系统、心血管系统、呼吸系统等系统疾病具有一定治疗作用[2]。红景天破壁饮片是将其传统饮片，经现代超微粉碎技术加工至D90 小于45 μm（300 目以上）的破细胞壁粉体，经不添加成型剂专利技术制成的30 ～ 100目干燥颗粒状饮片[3-4]。由于经破细胞壁工艺处理，破壁饮片已失去传统饮片的外观性状和显微鉴别特征，需引入可反映中药整体成分信息的HPLC 指纹图谱技术作为其质量评价的指标之一[5-7]。

本研究通过建立红景天传统饮片、破壁粉体及破壁饮片的HPLC 指纹图谱，对三者间的化学成分相关性进行分析，以评价红景天破壁饮片制备工艺过程中的成分传递信息以及批间成分一致性情况；进一步通过化学识别模式快速区分物质基础差异大的不同产地红景天样品[8-9]，为红景天破壁饮片的原料、中间体及成品质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695/2988 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；明澈TM-D24UV 型纯水系统（美国Milipore 公司）；KQ-700DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料

红景天苷（批号：110818-201507，99.4%）、酪醇（批号：111676-200602，100%）、没食子酸（批号：110831-201605，90.8%）均购于中国食品药品检定研究院；水为自制超纯水；乙腈、甲醇均为色谱纯，购于安徽时联特种溶剂股份有限公司；其余试剂为分析纯，购于广州化学试剂厂。

10 批红景天药材均从西藏和四川的不同区域采集，经中山市中智药业集团有限公司贾世清中药师鉴定为景天科植物大花红景天Rhodiola crenulata（Hook. f. et Thoms.）H.Ohba 的干燥根和根茎。红景天药材按传统方法制成红景天传统饮片，并以此为原料，按破壁饮片制备工艺规程分别制备成对应批次的红景天破壁粉体及破壁饮片（均由中山市中智中药饮片有限公司制备），样品信息见表1。

表1 红景天样品信息Tab. 1 Sample information of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Shiseido CAP Cell C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）的流动相进行梯度洗脱（0 ～ 25 min，5% ～ 15%A；25 ～ 45 min，15% ～ 23%A；45 ～ 70 min，23% ～ 28%A）；流速：0.6 mL/min；检测波长：275 nm；柱温：30 ℃；供试品溶液进样量：20 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取红景天样品0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，称重，浸润30 min，超声提取45 min，取出，冷却至室温，补重，摇匀，滤过，即得。

2.3 对照品溶液的制备

取没食子酸、红景天苷及酪醇3 种对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含没食子酸1.0 mg、红景天苷0.5 mg、酪醇0.2 mg 的混合对照品溶液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验取红景天破壁饮片，供试品溶液及空白供试品溶液按“2.2”项下的方法制备，按“2.1”项下的色谱条件进行测定。结果显示溶剂对样品的HPLC 分析无影响，表明该方法专属性良好。

2.4.2 精密度试验取1 份红景天破壁饮片，供试品溶液按“2.2”项下的方法制备，连续进样6 次，记录色谱图。各谱图相似度大于0.99；计算其它各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 值（以1 号没食子酸峰为参照峰），结果均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验取同一批红景天破壁饮片6份，供试品溶液按“2.2”项下方法制备，进样分析。各谱图相似度大于0.99；计算其它各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 值，结果均小于3%，表明方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验取1 份红景天破壁饮片，供试品溶液按“2.2”项下的方法制备，并于制备后0、2、4、8、12、24 h 时进样分析。各谱图相似度大于0.99；计算其它各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 值，结果均小于5%，表明供试品溶液在24 h 内较稳定。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

取10 批次不同产地的红景天传统饮片及其对应批次的破壁粉体和破壁饮片，按“2.2”项下的供试品制备方法制备相应的供试品溶液，进样测定，记录指纹图谱。通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 A 版）”软件分别建立红景天传统饮片、破壁粉体、破壁饮片的指纹图谱共有模式，计算10 批传统饮片、10 批破壁粉体、10 批破壁饮片各自的相似度。结果显示红景天传统饮片、破壁粉体及破壁饮片指纹图谱均标定了18 个共有峰，经对照品指认，1号峰为没食子酸，2 号峰为红景天苷，4 号峰为酪醇（见图1）；10 批传统饮片中编号1、2、3 间的相似度达0.96 以上，而与其它批次传统饮片的相似度低于0.85；编号4、5、6、8、9 间的相似度达0.95 以上，而与其它批次传统饮片的相似度低于0.90；编号4、7、10 间的相似度较高，而与其它批次传统饮片的相似度低于0.85。10 批破壁粉体及10 批破壁饮片也随着传统饮片表现出相同规律。

图1 混合对照品峰的指认Fig. 1 Peak identification of hybrid reference substance

2.6 红景天传统饮片、破壁粉体、破壁饮片相关性分析

将10 批红景天传统饮片、破壁粉体及破壁饮片的指纹图谱共有模式进行相似度分析（见图2 和表2），且分别将同批次的红景天三态（传统饮片、破壁粉体及破壁饮片）指纹图谱进行比较（见图3）。结果均显示红景天传统饮片、破壁粉体、破壁饮片之间的相似度极高（均大于0.99），说明红景天传统饮片经破壁粉碎技术及无添加成型技术制成破壁饮片成品的整个工艺流程中，成分传递好，有效成分整体概貌基本没有发生改变。

图2 红景天传统饮片、破壁粉体、破壁饮片指纹图谱共有模式比较Fig. 2 Comparison of the mutual mode of HPLC fingerprint of decoction pieces, ultrafine powder and ultrafine granular powder of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

表2 红景天传统饮片、破壁粉体、破壁饮片的相似度Tab. 2 Similarity of decoction pieces, ultrafine powder and ultrafine granular powder of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma

2.7 主成分分析（PCA）和聚类分析（HCA）

以18 个共有峰的峰面积为变量，分别采用SIMCA 14.1 软件、SPSS 26.0 软件对上述各10 批红景天传统饮片、破壁粉体及破壁饮片样品进行PCA、HCA 分析。结果显示：三个主成分的累计贡献率为84.16%，从PCA 得分图可知（见图4），30 个红景天样品明显分为3 类，其中样品编号为1、2、3 的传统饮片及其制备的破壁粉体、破壁饮片为一类；编号为4、7、10 的传统饮片及其制备的破壁粉体、破壁饮片为一类；编号为5、6、8、9 的传统饮片及其制备的破壁粉体、破壁饮片为一类；从HCA 树状图可知（见图5），当平方欧式距离为5 时，不同产地红景天样品的分类结果与PCA 结果一致。

3 讨论

本研究分析了不同产地的10 批红景天传统饮片及以其为原料所制备的破壁粉体、破壁饮片的HPLC指纹图谱。以HPLC 指纹图谱的相似度对红景天破壁饮片、破壁粉体及传统饮片进行成分相关性分析时，表现出极高的相似度，表明红景天破壁饮片的整个制备过程中，未出现成分种类的新增或消失，整体概貌未变化，具有同质性。且所采集的不同产地红景天药材，其传统饮片图谱相似度差异较大，并将成分差异进一步延续至破壁饮片中间体和成品。其PCA、HCA 分析也非常清晰地将HPLC 指纹图谱相似度高的样品归为一类，而差异大的归为其它两类，进一步佐证了指纹图谱相似度评价结果。结果提示，产地的生态环境对红景天药材生长过程中的成分富集影响较大，为保证以其为原料的中药成品质量稳定、一致，应对红景天药材的产地及加工方法进行控制和要求。HPLC 指纹图谱技术虽然克服了单一成分信息量不全的缺点，能较全面、整体反映成分概貌，但具有一定的模糊性，不能清晰反映成分的含量变化情况。为反映破壁饮片与其传统饮片的“同量性”，后续还将进一步通过化学计量学技术筛选饮片中的质量标志性成分，并对其进行含量测定，分析破壁饮片与其传统饮片的含量相关性情况，更全面地表征由传统饮片加工成破壁饮片的成分传递信息。