多酚化合物对黄嘌呤氧化酶抑制作用的研究进展

洪鑫月 吴健妹 罗小乔 刘 凯 周伟杰 张国文

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XOD)是体内核酸代谢中重要的酶，能催化次黄嘌呤氧化生成黄嘌呤，再将黄嘌呤氧化产生尿酸[1]。由于人体内缺乏尿酸氧化酶，不能将尿酸进一步分解成可溶性的尿囊素，因此，当体内XOD活性异常增高时，会造成尿酸生成增多，尿酸的积累或排泄不畅将导致高尿酸血症，长期的高尿酸血症会导致尿酸钠晶体在关节、组织等处沉积，引发痛风等症状。据统计[2]，约有5%～12%的高尿酸血症最终可发展为痛风。高尿酸血症不仅是痛风的生化基础，还与代谢综合征、糖尿病、慢性肾病、高血压、冠心病等疾病的发生发展密切相关[3]。随着生活水平的提高和饮食结构的改变，人们对高嘌呤类食物的摄入量也日益增加，高尿酸血症发病率在中国逐年上升，目前已达1.2亿人，且发病年龄呈现低龄化的趋势[4]，高尿酸血症已成为危害人民健康的严重代谢性疾病。

XOD是人体产生尿酸的限速酶，同时也是治疗高尿酸血症药物的作用靶点，抑制XOD的催化活性，减少黄嘌呤向尿酸转化，已成为临床缓解和治疗高尿酸血症的主要途径之一[5]。别嘌呤醇(Allopurinol)和非布索坦(Febuxostat)等是目前临床最常用的XOD抑制剂，前者通过抑制黄嘌呤与Mo-pt中心的配位作用[6]，后者通过占据酶的疏水空腔阻止与黄嘌呤的结合以抑制酶催化活性，从而达到降尿酸的目的[7]，然而这些化学合成抑制剂在临床使用中常引起发热、皮疹、腹痛、腹泻、白细胞与血小板减少以及肝肾损伤等不良反应[8]，从而使其应用受到限制。因此，寻找活性高、毒副作用小且作用机制明确的新型XOD抑制剂已成为亟待解决的重要课题之一。

多酚化合物是许多天然植物的主要有效成分，具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗高血压、降血糖、抗炎抑菌、抗病毒、抗癌等广谱药理活性和低毒性，是食品功能因子和新药研发的重要资源。近年来，多酚化合物对XOD的抑制作用受到国内外学者的广泛关注，已有较多的报道。文章拟重点对近5年来多酚化合物抑制XOD活性及其相互作用研究进行综述，以期为多酚类化合物作为降尿酸食品功能因子或药物的研发提供依据。

1 黄嘌呤氧化酶

2 多酚化合物对XOD的抑制作用

多酚化合物是广泛存在于植物中的一类含有酚基团的次生代谢产物，目前在自然界中已经发现8 000多种多酚类化合物，其结构复杂，有的可以与单糖或多糖结合成苷，还有的以衍生物的形式存在。多酚化合物按照其结构式和化学基团的不同主要分为黄酮类、酚酸类、单宁类、香豆素类和二苯乙烯类。研究[11-12]表明，多酚化合物具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗炎抑菌、抗病毒、抗癌等生理活性。近年来，多酚化合物尤其是黄酮类和酚酸类化合物对XOD的抑制作用受到国内外学者的高度关注，显示出该类化合物具有进一步发展成为高效XOD抑制剂的潜能。

2.1 黄酮类化合物对XOD的抑制作用

黄酮类化合物是由C6-C3-C6骨架构成的一系列化合物的总称，由两个苯环(A环和B环)通过3个碳(C)相互连接而成，该类化合物根据B环连接位置及3碳链氧化程度和是否成环等可分为黄酮、黄酮醇、异黄酮、二氢黄酮、黄烷酮、花青素和查尔酮等[13]。针对XOD的抑制作用，黄酮类化合物目前已有较多的报道，是多酚化合物中研究最多的一类化合物。

2.1.1 黄酮 Lin等[14]报道白杨素、芹菜素均有较强的XOD抑制活性，白杨素的半抑制浓度(IC50)为1.26 μmol/L，低于阳性对照别嘌呤醇的IC50(2.93 μmol/L)，其抑制XOD的能力强于芹菜素(IC50=3.57 μmol/L)，是一种可逆的竞争型抑制剂。闫家凯[15]采用酶促动力学方法研究了木犀草素对XOD的抑制作用，发现木犀草素能够有效地抑制XOD活性，是一种可逆的竞争型XOD抑制剂，其IC50为4.79 μmol/L，抑制常数Ki为2.38 μmol/L。Orsolya等[16]报道香叶木素对XOD的抑制能力比木犀草素更强，二者的IC50分别为0.53，0.84 μmol/L。马文涛[17]报道芹菜素、木犀草素、木犀草苷的IC50分别为0.060，0.022，0.047 mmol/L，三者均可以较好地抑制XOD活性，且抑制率均>50%，对XOD的抑制类型属于可逆性抑制。芹菜素、苜蓿素属于混合型XOD抑制剂，对游离酶的抑制作用强于对酶—底物复合物的抑制作用，且苜蓿素的IC50为4.13 μmol/L[18]。笔者团队[19]发现黄芩素有较强的XOD抑制能力，而黄芩苷的抑制活性较弱，均为混合型可逆抑制剂，在抑制50%和70% XOD活性水平时，黄芩素与别嘌呤醇联用具有一定的协同抑制作用，而黄芩苷与别嘌呤醇的联合使用仅在抑制50% XOD活性时存在协同效应，在抑制30%和70% XOD活性时，二者联用显示出拮抗作用，而黄芩素与黄芩苷联用在抑制30%，50%和70% XOD活性时均有较好的协同作用。还有文献[20]35-37报道异泽兰黄素、泽兰黄酮、高车前素、棕矢车菊素及半齿泽兰素均表现出较好的XOD抑制效果，其IC50分别为0.72，3.98，7.53，16.00，42.20 μmol/L，其中泽兰黄酮只能与游离酶结合，属于竞争型XOD抑制剂，其他4种化合物均为混合型抑制剂。

2.1.3 异黄酮 异黄酮具有3-苯基色原酮基本骨架，其B环连接位置与黄酮有所不同，因主要存在于豆科植物特别是大豆中，也被称为大豆异黄酮。染料木素属于异黄酮，IC50为1.73 μmol/L，抑制常数Ki为1.39 μmol/L，是一种活性很强的可逆竞争型XOD抑制剂。染料木素与芹菜素互为同分异构体，二者仅B环的连接位置不同(染料木素B环连接在C-3位，芹菜素为C-2位)。染料木素的B环可以插入XOD的疏水空腔，与氨基酸残基之间存在的π—π相互作用使其能稳定在空腔内而具有更强的抑制活性[31]46-48。葛根素对XOD的抑制活性较弱，IC50为555.2 μg/mL，当其质量浓度>60 μg/mL时，抑制率也仅有18%，造成抑制能力不强的原因很可能是结构中存在较大体积的取代基团使其不易与酶的活性位点结合[25]54-55[32-33]。

此外，越来越多的动物试验[38-39]也表明，富含黄酮类物质的食物可显著抑制动物体内XOD活性，降低模型动物体内的尿酸生成。近年来，作为潜在的酶抑制剂，黄酮类化合物的合成与生物活性研究日益增多，研究也更加倾向于其药用价值的开发。

2.2 酚酸类化合物对XOD的抑制作用

酚酸类化合物是指在一个苯环上有多个酚羟基取代的芳香羧酸类化合物[40]，它们在自然界特别是水果、蔬菜、茶和咖啡等食物中广泛存在，现阶段对XOD的抑制作用研究主要集中在咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、没食子酸等酚酸类化合物。Lin等[41]报道几种酚酸对XOD的抑制能力，其IC50值依次为：咖啡酸(7.16 mmol/L)>绿原酸(6.49 mmol/L)>对香豆酸(5.58 mmol/L)>丁香酸(4.36 mmol/L)>阿魏酸(3.45 mmol/L)>芥子酸(2.88 mmol/L)>别嘌呤醇(8.50 μmol/L)，显示出相对温和的XOD抑制活性，且均为混合非竞争型抑制剂，也有文献[42-43]报道咖啡酸、绿原酸和阿魏酸的抑制类型均为竞争型。Masuda等[44]发现咖啡酸氧化物对XOD的抑制作用远强于咖啡酸，为别嘌呤醇的18倍。迷迭香酸的水溶性较差，溶液中溶解度仅有5%，其抑制XOD活性的能力(IC50=14.78 mg/mL)比咖啡酸(IC50=2.82 mg/mL)更弱，是一种竞争型XOD抑制剂[45-46]。没食子酸是一种可逆的偏竞争型的混合型XOD抑制剂，IC50为183.61 μg/mL[33]。单一的没食子酸抑制能力较弱，在维生素C的协同下其抑制率达到40.96%，比同浓度的没食子酸提高了近15%，这可能与维生素C的强还原性阻止没食子酸被氧化降解有关[30]。没食子酸衍生物(辛基、癸基和十二烷基没食子酸)均为XOD的竞争型抑制剂，对XOD的抑制作用会随烷基碳链的增长而增强[47]。张婧妍等[48]报道丹酚酸A通过与底物竞争结合于酶的活性中心从而抑制XOD活性，抑制类型为竞争型，IC50为65.49 μmol/L，Ki值为28.5 μmol/L。杜洪芳等[49]测得原儿茶酸抑制XOD的IC50值为0.38 mmol/L，其抑制能力与杨梅素相当(IC50=0.32 mmol/L)。

2.3 其他类多酚化合物对XOD的抑制作用

研究[50-51]表明，其他的多酚化合物如儿茶素类、二苯乙烯类等也有一定的XOD抑制活性。表儿茶素没食子酸酯(ECG,IC50=0.90 mmol/L)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,IC50=0.49 mmol/L)均具有一定的XOD抑制活性，而儿茶素(C)、表儿茶素(EC)和表没食子儿茶素(EGC)无明显的XOD抑制能力。Tang等[52]研究几种二苯乙烯类化合物对XOD的抑制作用，发现白皮杉醇是竞争型XOD抑制剂，土大黄苷、白藜芦醇和异丹叶大黄素属于非竞争型抑制剂，其IC50分别为6.440，5.997，3.880，46.750 μmol/L，显示出良好的体外抑制能力。Dong等[37]发现短叶松素在不同的底物下对XOD的抑制作用有所差异，底物为次黄嘌呤时，低浓度(15～200 μmol/L)短叶松素才对XOD有抑制作用，IC50为125.10 μmol/L；底物为黄嘌呤时，短叶松素为混合型抑制剂，其IC50为137.32 μmol/L。Liu等[53]发现2’,4’-二甲氧基-4,5’,6’-三羟基查耳酮是一种混合型XOD抑制剂，IC50为0.21 μmol/L(别嘌呤醇为2.07 μmol/L)，有很强的体外XOD抑制活性。孙永丽等[54]报道7,3’,4’-三羟基-3-苄基-2氢-苯并吡喃、3-去氧苏木酮B、苏木查尔酮和原苏木素A均有一定的XOD抑制活性。刘雪梅[55]发现姜黄素对XOD的抑制能力与乔松素相当，但弱于山奈酚和高良姜素。异甘草素也有良好的XOD抑制能力(IC50=19.32 μmol/L)，其抑制活性呈浓度依赖性[56]。

2.4 多酚类金属配合物对XOD的抑制作用

多酚类化合物与金属离子形成配合物，不仅能提高水溶性、稳定性和生物利用率，而且还可以增强多酚类化合物的药理活性。Dong等[57]报道木樨草素—锰(II)配合物体外抑制XOD活性比相同浓度的母体木樨草素高出18.6%。邢志华等[58]报道芹菜素—钆(III)配合物能显著降低高尿酸血症小鼠血清中XOD的活性和血清尿酸水平，且其促进尿酸排泄和清除超氧自由基能力均优于芹菜素。笔者团队[59]前期研究发现白杨素—铜(II)配合物对XOD的抑制能力比母体白杨素提高了1.5倍，主要是由于Cu2+发挥了桥梁作用使白杨素更容易结合到XOD的Mo-pt中心，占据了酶活性中心，导致酶结构紧缩，阻碍底物黄嘌呤与活性中心的作用，从而导致白杨素—Cu(II)配合物有更强的抑制能力。尽管目前多酚类金属配合物对XOD抑制作用的研究还比较少，但已有的报道表明多酚金属配合物可能是一类有良好前景的潜在XOD抑制剂。

3 多酚化合物与黄嘌呤氧化酶的相互作用

研究多酚化合物与XOD之间的相互作用，分析二者的结合常数、结合位点数、主要作用力、结合位点及参与作用的主要氨基酸残基，研究多酚化合物诱导XOD结构的变化对酶催化底物的影响，对于从分子水平上阐明多酚化合物抑制XOD的分子机制具有重要的意义。

3.1 黄酮类化合物与XOD的相互作用

绝大多数黄酮类化合物能与XOD结合形成复合物，结合常数在104～105L/mol，为中等强度的结合亲和力，结合位点数为1，对XOD的荧光猝灭机制大多为静态猝灭。Lin等[60-61]报道染料木素和白杨素对XOD的猝灭类型为静态猝灭，二者有一个结合位点，结合常数分别为5.24×104，7.98×105L/mol，氢键和疏水作用力为染料木素与XOD结合的主要驱动力，白杨素与XOD的结合则主要由氢键和范德华力驱动。Zhang等[23-24,62]研究了3种黄酮类化合物槲皮素、高良姜素和杨梅素与XOD的相互作用，发现它们的结合常数大小为：4.28×104L/mol(槲皮素)>3.60×104L/mol(高良姜素)>3.24×104L/mol(杨梅素)，杨梅素、槲皮素与XOD的结合过程主要由范德华力和氢键驱动，氢键和疏水相互作用主导了高良姜素与XOD的结合，它们都通过静态方式猝灭XOD的内源荧光。王亚杰等[63]报道桑色素通过疏水作用力与XOD结合形成复合物静态猝灭XOD的荧光，结合常数为2.32×104L/mol。而橙皮苷和EGCG由于自身含有较多的羟基，与氨基酸残基之间也可能存在静电作用[64]。曾霓[65]27-31报道黄芩素、漆黄素、橙皮素对XOD均为静态猝灭，而黄芩苷对XOD的猝灭则同时存在静态与动态两种类型，其在XOD上都只有一个结合位点和中等强度的结合亲和力，结合常数从大到小依次为黄芩素(9.10×104L/mol)>黄芩苷(8.93×104L/mol)>橙皮素(8.27×104L/mol)>漆黄素(5.97×104L/mol)，氢键和疏水作用力是这些黄酮类化合物与XOD作用的主要驱动力。

同步荧光光谱研究表明，黄酮类化合物与XOD相互作用常常会引起XOD酪氨酸和色氨酸残基周围的微环境发生改变。李梦荣[20]40-42报道异泽兰黄素的存在会导致XOD色氨酸残基周围极性增加和疏水性降低，而对酪氨酸残基周围的微环境则无明显影响。槲皮素能引起XOD酪氨酸残基周围的疏水性增强，色氨酸残基周围的疏水性降低和极性增加[62]。利用同步荧光猝灭比率(RFSQ)可以评估色氨酸和酪氨酸残基对XOD荧光猝灭的贡献大小。Zhang等[23]报道高良姜素Δλ=60 nm处的RFSQ值>Δλ=15 nm处的值，色氨酸对XOD内源荧光猝灭的贡献大于酪氨酸，认为高良姜素与XOD的结合位点更靠近色氨酸残基。

黄酮类化合物与XOD结合往住导致XOD结构发生改变，影响酶活性中心的形成及其与底物作用，从而降低酶的活性。叶素梅[67]报道芹菜素与XOD的结合会引起XOD的α-螺旋和β-折叠含量增加，β-转角和无规则卷曲的含量降低，使得XOD的二级结构更加紧密，不利于酶形成活性中心。Zhang等[24]报道杨梅素与XOD结合会引起XOD的α-螺旋和无规卷曲含量增加，β-折叠和β-转角的含量减少，更加紧缩的酶结构削弱了XOD的催化活性。而山奈酚则使XOD二级结构中α-螺旋和无规卷曲的含量降低，β-折叠和β-转角的含量增加，山奈酚破坏了XOD的氢键网络，导致酶多肽部分伸展，稳定性降低，从而影响酶的活性[22]。

3.2 酚酸类化合物与XOD的相互作用

现阶段咖啡酸、绿原酸等酚酸类化合物与XOD之间相互作用受到更多的关注。Wan等[42]报道咖啡酸会使XOD分子结构变得无序而影响其催化活性，具体表现为α-螺旋含量降低，β-折叠、β-转角和不规则性含量增加。分子模拟结果表明，咖啡酸作用于XOD的Mo-pt中心的疏水空腔，并与氨基酸残基Glu802、Agr880、Thr1010形成氢键，其在XOD上结合区域与黄嘌呤相同。绿原酸能够通过静态和动态复合猝灭方式猝灭XOD的荧光，结合常数为2.39×106L/mol，氢键和范德华力是二者作用的主要驱动力，绿原酸与XOD结合导致XOD的α-螺旋含量增高，β-折叠含量降低，XOD的结构变得更加紧缩，影响酶与底物作用从而降低酶的活性[70-71]。朱大帅[72]报道绿原酸与XOD上的氨基酸残基Glu1016、Asn1073形成氢键，与咖啡酸相比，绿原酸在化学结构上多一个六元环，分子体积过大使其不能进入XOD的活性口袋而暴露在外，且不能与XOD通过网格状氢键结合，导致绿原酸与XOD的结合不够牢固，影响了其对XOD的抑制活性。王雪洁等[73]发现异绿原酸B(3,4-二咖啡酰奎宁酸)结合到XOD的疏水口袋，其三咖啡酰基上的酚羟基与Glu802和Mos3004形成氢键，酰基与Ser876形成氢键，四咖啡酰基上的酚羟基与Glu879形成氢键，且与Ala1079、Ala1078、Arg880、Phe914、Leu873、Thr1010、Leu648、Lys771、Leu1014、Phe1013、Phe649、Val1011、His875和Phe1009等残基产生疏水作用。张婧妍等[48]报道丹酚酸进入XOD的活性口袋，其1,2-二芳基乙烯基团伸入位于Mo-pt结构域的疏水性区域，3,4-二羟基芳基丙酸基团游离于活性口袋袋口处，其结构中的游离羟基与氨基酸残基Gln767、Asn768、Arg880、Thr1010形成氢键，且苯环结构还与氨基酸残基Phe914、Phe1009产生π—π效应。

3.3 其他多酚化合物与XOD的相互作用

除黄酮类和酚酸类化合物之外，目前其他多酚化合物与XOD相互作用的研究还比较少。李昕卓等[64]报道白藜芦醇能够与XOD相互作用形成复合物，二者有中等强度的结合亲和力，氢键和疏水作用力是其结合的主要驱动力。白藜芦醇结合于XOD活性中心Mo-pt结构域附近，与钼喋呤Mos3004活性中心附近的Thr1010、Ala1079形成氢键，并与氨基酸残基Leu648、Phe649、Glu802、Leu873、Ser876、Phe914、Phe1009、Val1011、Leu1014、Ala1078及钼喋呤Mos1334活性中心间存在疏水相互作用，其结合区域与底物相同，而EGCG结合在XOD的FAD活性中心附近，被氨基酸残基Gly46/350、Leu74/305、Glu263、Ile266、Phe337、Ala346、Asn351和Asp360包围，并与氨基酸残基Glu45、Ser347、Thr262、Ile358、Arg426和Lys433形成氢键。Zhang等[74]报道矢车菊素-3-槐苷-5-葡萄糖苷与XOD的氨基酸残基Asn768、Glu802、Ser876和Gln1122形成7个氢键。矢车菊素-3-(6’咖啡酰基-6”-阿魏酸槐苷)-5-葡萄糖苷与活性位点周围的Leu648、Agr871、Glu879、Agr880、Thr1010和Gln1122残基形成5个氢键，其6’-咖啡酰基插入疏水空腔与Arg880和Thr1010形成氢键，花色苷的酰化基团插入XOD的疏水口袋后通过与底物竞争而占据酶的催化中心可能是其抑制XOD活性的主要原因。

4 结论与展望

多酚化合物作为具有广泛药理活性的植物活性成分，近年来，其对XOD抑制活性和相互作用的研究已有较多的文献报道，取得了较好的研究进展，为该类化合物作为降尿酸食品功能因子和药物的研发提供了科学依据，但多酚化合物的结构与其抑制XOD活性之间关系的研究还比较欠缺，对XOD抑制机制的认识也较为有限，还需要采用更加有效的策略进行深入探讨。此外，由于多酚类化合物存在稳定性弱和溶解性差等不足而使其作为功能因子的生物利用率受到影响，因此，以天然多酚为先导化合物，对其结构进行修饰、改造或合成金属配合物，开发出高效、安全且水溶性和稳定性更好的新型降尿酸化合物，是值得进一步探索的研究方向。