基于TCGA数据库探讨食管癌免疫细胞浸润模式与临床特征和预后的相关性研究

米琛，蒋荣伟，任莉，师文，罗玉梅

食管癌是全世界第六大常见的癌症死亡原因，作为发病率及病死率较高的消化系统肿瘤，食管癌的治疗与预后是全球医疗卫生系统的一个重大的健康挑战[1]。食管癌因其早期诊断率低、耐药性强及复发率高等原因使其具有高死亡率，食管癌患者的生存率较低[2]。到目前为止，该疾病早期仍以手术治疗为主要治疗方案，晚期患者多采用综合治疗的方式以缓解患者痛苦，提高生命质量[3]。虽然手术切除和明确的化疗作为一种单一的治疗方式最初是有效的，但是顺铂和5-氟尿嘧啶(5-Fu)联合化疗会导致长期生存率低，且复发率和耐药率较高[4]。所以，致力于寻找食管癌治疗的新靶点至关重要。

近年来，肿瘤与免疫学治疗的关系受到极大的关注[5]。与手术和放化疗等方法不同，免疫治疗通过恢复T淋巴细胞对肿瘤细胞的识别及杀伤作用治疗癌症[6]。其中，程序性死亡蛋白-1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡蛋白配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1)抑制剂是研究较为成熟且应用较广的免疫抑制剂，PD-1/PD-L1免疫治疗也成为人类恶性肿瘤治疗历史上的一次飞跃。帕博利珠单抗作为人源化的免疫球蛋白G4单克隆PD-1抗体，能够通过抑制PD-1与PD-L1结合使细胞毒性T细胞识别肿瘤细胞[7]。食管癌的多中心Ⅰ期研究表明，帕博利珠单抗对PD-L1阳性的晚期食管癌患者具有良好的初步抗肿瘤活性和可控制的毒性，PD-L1阳性与PD-L1阴性食管癌患者的疾病客观缓解率分别为13.8%和6.3%[8]。还有研究表明，肿瘤微环境中高PD-L1表达可使免疫细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤能力减弱，这也是应用PD-1/PD-L1抑制剂的基础[9]。美国国家综合癌症网络指南也推荐对局部晚期、复发性或存在转移的食管腺癌进行PD-L1检测，PD-L1高表达的患者可选择使用PD-1/PD-L1抑制剂[10]。因此，筛选食管癌免疫治疗的获益人群是提高其治疗和改善预后的有效方法之一。肿瘤中发生浸润的免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，其浸润模式与临床结果存在一定相关性，并可能成为药物靶标来提高生存率，因此，分析食管癌浸润性免疫细胞的组成特点，以及浸润模式与临床特征和预后的相关性，有利于临床筛选食管癌免疫治疗的获益人群。鉴于此，本研究应用 Cibersort 软件对公共数据库癌症基因组图谱(TCGA数据库)中食管癌患者的基因表达数据和临床数据进行分析，以期为进一步提高食管癌的生存率奠定基础。

1 资料与方法

1.1 数据来源

从公共数据库癌症基因图谱(the cancer genome atlas, TCGA, https://cancergenome.nih.gov/)中下载所有食管癌基因表达数据共 171 例，其中包含食管癌组织160 例、正常食管组织 11 例，并下载 183 例食管癌样本的相关临床数据，包括年龄、临床分期、肿瘤分级和生存状态等。

1.2 数据处理方法

1.2.1 计算食管癌中浸润性免疫细胞的组成

安装Perl软件并将基因表达数据整理成行名为基因名、列名为样品名的矩阵，提取获得食管癌组织和正常组织转录本的mRNA表达谱数据，使用R语言limma包、 BiocManager包将表达谱矩阵校正，用Cibersort软件(http://cibersort.stanford.edu/)来计算每个肿瘤组织中M1巨噬细胞、 M2巨噬细胞、 M0巨噬细胞、滤泡辅助性T细胞、中性粒细胞等共22种浸润性免疫细胞类型的相对比例。为进一步提高精度，以Cibersort软件中P<0.05为标准进行样本筛选，筛选出有意义的样本后，利用R语言及相应包绘制样本中每种免疫细胞的柱状图(即食管癌及正常样本中各种免疫细胞占比)、相关性热图(即食管癌组织样本中每种免疫细胞占比的相关性)和小提琴图(即可视化免疫细胞在食管癌及正常组织中的分布)。

1.2.2 评估食管癌免疫细胞浸润模式与临床特征和预后的相关性

将上述转录本数据结合临床数据，评估食管癌免疫细胞浸润模式与临床特征(年龄、性别、临床分期、肿瘤分级)及预后的相关性。

1.3 统计学方法

使用R语言(3.6.1版本)和Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)进行统计学分析。对于丢失的数据，则应用列表删除法进行处理，如果缺少任一单个值，则将该样本整体排除。以R语言中的corrplot包绘图进行不同免疫细胞间相关性的检测；采用Perl分析食管癌免疫细胞浸润模式与临床特征的相关性；再根据免疫细胞水平中位值将患者分为高、低浸润组，应用R语言中的survival包，通过Kaplan-Meier Log-rank法计算其与生存的相关性，并绘制图形。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌样本的临床病理特征

183例食管癌样本中，男性患者156例(85.2%)， 女性患者27例(14.8%)；临床分期为T0者1例(0.5%)，T1者31例(16.9%)， T2者43例(23.5%)， T3者86例(47.0%)， T4者5例(2.8%)，未知17例(9.3%)；M0者134例(73.2%)，M1者9例(4.9%)，MX者18例(9.8%)，未知22例(12.0%)；N0者76例(41.5%)，N1者68例(37.2%)，N2者12例(6.6%)，N3者8例(4.4%)，NX者2例(1.1%)，未知17例(9.3%)；生存状态为存活74例(40.4%)，死亡109例(59.6%)。

2.2 食管癌组织浸润免疫细胞情况

采用Cibersort评估了160例食管癌和11例正常组织免疫细胞的分布情况，利用R语言及相应包绘制的柱状图、相关性热图和小提琴图分别如图1、图2、图3所示。图1和图3显示，食管癌肿瘤组织与正常组织相比，M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、活化的CD4+记忆性T细胞含量较高；浆细胞、M2巨噬细胞、静息状态的肥大细胞的含量较低。图2显示，在食管癌组织中，构成比相关系数较大的免疫细胞包括： 静息状态的CD4+记忆性T细胞与滤泡辅助性T细胞(-0.51)，静息状态肥大细胞与活化的肥大状细胞(-0.46)，记忆B细胞与幼稚B细胞(0.45)。

图1 食管癌及正常样本中各种免疫细胞占比的柱状图

图2 食管癌组织样本中每种免疫细胞占比相关热图

图3 食管癌及正常组织中免疫细胞构成小提琴图(蓝色：正常组织；红色：肿瘤组织)

2.3 食管癌免疫细胞浸润模式与临床特征的相关性

2.3.1 与年龄和性别的相关性 根据年龄是否>50岁和患者性别进行分层分析，结果显示，各免疫细胞含量与年龄分级和性别之间，均无显著相关性(P>0.05)。

2.3.2 与临床分期和肿瘤分级的相关性 根据临床分期和肿瘤分级进行分层分析，结果显示，M0巨噬细胞的含量与临床N分期成负相关，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 食管癌免疫细胞与临床N期的相关性

2.4 食管癌免疫细胞浸润模式与预后的关系

根据各免疫细胞构成比中位值高低，采用Kaplan-Meier Log-rank法计算其与生存的相关性，结果显示，静息状态树突状细胞和活化的肥大细胞构成水平对患者生存有显著影响(P<0.05)，其中，静息状态树突状细胞与活化的肥大细胞细胞构成比高者总生存期短，见图5。

图5 免疫细胞构成水平的Kaplan-Meier曲线 A：静息状态树突细胞构成水平Kaplan-Meier曲线; B：活化的肥大细胞构成水平Kaplan-Meier曲线

3 讨论

在较多的科学研究中多用免疫组化法或流式细胞术来分析肿瘤组织免疫细胞的浸润模式，具有操作繁琐，效率低下的弊端，本研究采用的Cibersort软件由斯坦福大学医学院的研究人员Newman等于2015年发明，该软件采用了反卷积算法，可准确、快速地分析复杂组织的基因表达谱数据，优势较为突出[11]。本文首先基于 TCGA 数据库中食管癌患者的基因表达数据和临床数据，对食管癌浸润性免疫细胞的组成特点进行了统计分析，结果显示，与正常组织相比，食管癌肿瘤组织中，M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、活化的CD4+记忆性T细胞含量较高；浆细胞、M2巨噬细胞、静息状态的肥大细胞的含量较低，且有三对免疫细胞之间的构成比相关系数较大，说明这些免疫细胞可能参与了食管癌的发生与发展，食管癌组织中免疫细胞的组成可能存在一定的特异性，可为该病的早期筛查与诊断提供参考。

进一步对食管癌组织中免疫细胞浸润模式与临床病理特征的相关性进行分析，结果显示，M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、活化的CD4+记忆性T细胞、浆细胞、M2巨噬细胞、静息状态的肥大细胞的含量变化较大。并且本文经过分析发现，M0 巨噬细胞与患者临床N分期呈负相关，这一分析结果揭示了免疫浸润细胞模式能够检测或者用于预测食管癌的临床分期。与此同时，本研究对患者性别与年龄进行数据分析，结果发现，年龄和性别与各种免疫细胞并无显著相关性，综合以上分析，临床分期可能是影响食管癌免疫浸润细胞浸润模式的重要因素之一。在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤分期也不断发生变化，同时也伴随着免疫细胞浸润模式发生着改变。作为免疫浸润细胞之一的巨噬细胞，根据其免疫功能的不同可以分为M1和M2巨噬细胞两种类型。M1巨噬细胞是由前体M0巨噬细胞在干扰素-γ刺激下活化而形成，其主要进行各种炎症反应以及对抗肿瘤细胞的免疫应答反应，能够显著地对抗肿瘤生成；M2型巨噬细胞是在Th2分泌的细胞因子如IL-4和IL-13作用下分化形成，有助于组织的修复，参与了纤维化和体液免疫，同时还具有激活肿瘤细胞增殖的作用，能够促进肿瘤的生长[12-13]。本文研究发现，M0巨噬细胞与患者临床N期呈现负相关，这解释了随着肿瘤分期进程不同，患者体内的M0巨噬细胞的含量发生变化，M0在干扰素的刺激下形成M1巨噬细胞，间接影响着M1巨噬细胞的增殖，从而对食管癌的发生发展产生作用[14]。

接下来对食管癌组织中免疫细胞浸润模式与预后的相关性分析结果显示，静息状态树突状细胞与活化的肥大细胞构成比高者总生存期相对较短，说明这两种免疫细胞在食管癌的预后预测中具有一定程度的价值。树突状细胞是功能最为强大的抗原呈递细胞，是CD4+T和CD8+T初始细胞主要的激活细胞[15]。它能够对抗原进行摄取和呈递，并将其迁移到淋巴器官并对T细胞进行激活而发挥免疫反应。这些特点使得树突状细胞在诱导和维持抗肿瘤免疫方面发挥着重要的作用。相关实验研究发现，树突状细胞是Treg细胞抑制抗肿瘤免疫应答的关键靶标。研究发现[16]，肿瘤内Treg细胞与肿瘤相关的CD11c+DCs相互作用，减少了树突状细胞共刺激配体的表达，进而能够对T细胞的增殖进行抑制。此外，清除Treg细胞能够恢复肿瘤相关的CD11c+DCs免疫原性，活化CD8+T细胞和表达共刺激分子，进而能够发挥抑制肿瘤的生长作用[17-18]。肥大细胞是一种独特的驻留在组织中的免疫炎症细胞，它能分泌一系列不同的生物活性化合物，这些化合物可以刺激、调节或抑制免疫反应。肥大细胞几乎遍布于全身器官，尤其在人体消化道中分布广泛[19-20]。刘柳等[21]将人食管癌EC109细胞株及其一系列对比处理移入小鼠腹腔内进行观察完整免疫体系对肿瘤细胞的免疫反应，结果发现，食管癌细胞移入小鼠腹腔，主要诱导T型肥大细胞参与免疫反应。本研究中，树突状细胞和肥大细胞构成比高者总生存期较长，说明该细胞可作为食管癌的预后预测指标。树突状细胞是作为人类免疫系统中功能最强的特异性抗原呈递细胞，可以激活肿瘤免疫治疗中的 T 细胞，发挥治疗作用。但是，目前对于静息状态的树突状细胞在肿瘤中的研究相对较少，需要后续的临床研究[22]。

综上所述，通过 Cibersort 软件对食管癌浸润免疫细胞组成进行生物信息学分析，可为免疫细胞与食管癌的相关性研究提供新的线索与思路：免疫细胞参与了食管癌的发生与发展，且与正常组织相比，食管癌组织中免疫细胞的组成存在一定的特异性，可为该病的早期筛查与诊断提供参考；肿瘤患者的不同临床分期可能存在不同的免疫细胞浸润模式，临床可以此为基础，对治疗药物的靶标进行探索，并进行有针对性的治疗来提高生存率。