鱼皮胶原蛋白提取方法研究及其在食品中的应用

周 瑞,陈舜胜

(上海海洋大学食品学院,上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306)

胶原蛋白又称胶原(Collagen),是很多动物体内含量最丰富、分布最广的一种糖蛋白[1],约占体内蛋白质总量的25%—30%,作为一种紧密有序的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)[2],它是由三个多肽链扭曲在一起形成三螺旋结构[3](图1)。目前,已知的胶原蛋白类型达到了29 种[4],其中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型是最主要类型[5]。Ⅰ型主要在骨骼、真皮、肌腱、韧带、角膜中,占全部胶原蛋白含量的90%左右,在日常生活中最为常见[6];II 型主要在软骨组织中;III 型在肺、肝、脾脏中,目前在水产品中尚未发现。

猪、牛皮骨中提取的胶原蛋白因为疯牛病(BSE)、口蹄疫(FMD)等牲畜疾病的暴发,引起了人们对胶原蛋白来源的担忧,从鱼皮、鱼鳞等水产品副产物提取的胶原蛋白成为一个很好的代替来源[7]。研究鱼皮胶原蛋白并加工利用,可以提高鱼类加工的附加值,同时达到保护环境的效果。

图1 胶原蛋白的三螺旋结构[3]Fig.1 Triple-helical structure of collagen[3]

1 鱼皮胶原蛋白的制备

鱼皮胶原蛋白的制备过程包括除杂、除脂、除杂蛋白,胶原蛋白析出、纯化等。

1.1 鱼皮的预处理

鱼皮中的其他物质会影响胶原提取率和胶原纯度,需对鱼皮进行预处理。步骤一般为:去除杂质、蒸馏水冲洗→将鱼皮剪成一定规格→加入0.1 mol∕L NaOH 或NaCl 溶液搅拌浸泡24 h(除去鱼皮的色素、肌原纤维等非胶原蛋白,同时使鱼皮软化)→加入10%有机试剂搅拌浸泡24 h(除去脂肪)[1]。使用NaOH浸泡还可达到杀菌除酶,精制胶原蛋白的效果[8]。

1.2 鱼皮胶原蛋白的提取

提取胶原蛋白的原理是把胶原蛋白从其他成分中分离出来。通常是依据胶原蛋白的特性,采用物理-机械方法或加入某种化学试剂来改变鱼皮胶原蛋白的存在环境,使胶原蛋白与其他成分分离并进行提纯达到提取效果。根据提取介质的不同分为以下几种。

1.2.1 热水提取法

热水提取法可提取水溶性胶原蛋白(Hot water-soluble collagen,HEC)。鱼皮预处理后,用热水直接提取胶原蛋白,温度过高时胶原蛋白没有明显的网状结构、发生变性和交联;温度过低则提取速率慢[9],常使用的温度有100 ℃、60—70 ℃、40—42 ℃、45 ℃,热水法得到的胶原蛋白被称为明胶(Gelatin)[10]。明胶不具备胶原蛋白初始功能,分子量遍布范围广,杂乱难确定,在食品领域制作胶冻食品价值较高。

郝淑贤等[11]用3 种提取方法提取罗非鱼皮胶原蛋白,并比较不同方法提取的胶原蛋白理化特性,研究发现热水提取法得到胶原凝胶强度较大。因此,可以根据需要,选用热水法提取,使用试剂少,且凝胶强度大,为制作胶冻食品提供参考;Supatra 等[12]研究了不同提取温度(45—75 ℃)对明胶的特性和凝胶性能的影响,发现55 ℃时提取的明胶凝胶强度最大,同时还发现温度升高时,明胶的颜色逐渐变淡,不同温度得到的产物在扫描电子显微镜下显示有所不同。温度对于提取胶原蛋白的影响,通常是破坏胶原蛋白三螺旋结构,进而影响性质。

1.2.2 酸提取法

酸提取法是提取酸溶性胶原蛋白(Acid-soluble collagen,ASC),利用低浓度酸溶液破坏Schiff 键和离子键,使没有交联的胶原蛋白和含有醛胺类交联键的胶原蛋白溶出。该方法对胶原蛋白的交联键破坏程度小,保持胶原蛋白的结构的完整,因此胶原蛋白中的β 和γ 大分子链较多,交联程度高的成分较多。酸提取中使用的酸有甲酸、乙酸、乳酸和柠檬酸等,其中最常使用的为乙酸[13]。

刘焱等[14]用4 种方法从鱼皮中提取胶原蛋白,提取率为酸法＞酶法＞碱法＞水法,其中傅里叶红外光谱显示除了碱法提取的胶原外均符合胶原特征吸收峰。陈丽丽等[15]用乙酸、乳酸、柠檬酸研究鮰鱼皮胶原的提取工艺,显示胶原蛋白提取率影响程度依次为乙酸＞乳酸＞柠檬酸,乙酸提取鮰鱼皮胶原提取率达38.44%。Tan 等[16]用三种酸法提取胶原蛋白,显示酸法提取和均质化辅助酸法提取的凝胶性高于酸辅酶提取,均质化辅助酸法提取可以应用于工业上提高胶原蛋白得率。淑英等[17]以鳕鱼鱼皮作为研究材料,考察不同酸类型、酸浓度、提取时间及料液比对胶原蛋白提取率的影响,应用响应面法得到优化提取工艺。总的来说,酸的浓度、种类、提取时间和料液比均是提取过程中影响提取率的因素。

1.2.3 碱提取法

碱提取法是利用强碱或强碱盐将胶原蛋白肽键水解,最终得到胶原蛋白。胶原蛋白三股螺旋结构被破坏,酰胺键水解断裂,会彻底破坏含硫和含羟基的半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸,甚至会产生有致癌、致畸和致突变作用的D 型氨基酸。

Yoshimura 等[18]提取碱溶性胶原蛋白,用含有10% NaCl 的0.5 mol∕L NaOH 在4 ℃下提取20—30 d,提取的胶原大部分由α1 和α2 链组成。顾杨娟[19]提取鱼胶原蛋白,采用酸法、碱法、酶法3 种方法,得出采用酶法提取出的胶原蛋白提取率最高,而碱法提取胶原蛋白的提取率低、冻力小。

1.2.4 酶提取法

酶提法从鱼皮中提取酶溶性胶原蛋白(Pepsin-solubilized collagen,PSC),是利用蛋白酶选择性的切除非螺旋的肽端而不影响三螺旋结构的情况下分离出胶原蛋白,常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶等[13]。

Liu 等[20]、Kaewdang 等[21]证明用蛋白酶提取的胶原蛋白三螺旋结构是完整的;Woo 等[22]对黄鳍金枪鱼背皮提取胶原的条件进行优化,确定了最佳酶解条件为加入0.98%(W∕V)胃蛋白酶浸提23.5 h;Tao等[23]用响应面法优化金枪鱼皮胶原蛋白提取,提取条件影响程度依次为料液比＞酶量＞提取时间;张培等[24]研究了从金枪鱼内脏中提取的酶提取罗非鱼鱼鳞胶原蛋白的提取率小于使用胃蛋白酶的提取率,表明影响提取率的因素还包括酶的种类。廖伟等[25]采用酶法提取尖吻鲈鱼鳞和鱼皮的胶原蛋白,每100 g鱼皮和鱼鳞的胶原蛋白提取量分别为47.3 g、2.3 g,结果显示鱼皮相对鱼鳞是更好的胶原蛋白来源。酶的作用受温度影响,当温度过低时提取速率慢,过高时酶失活或胶原变性[8],有研究显示多种酶的使用也会提高提取效果。总的来说,影响提取效果的因素不仅与胶原蛋白来源有关,也与所使酶的种类、料液比、酶量、提取时间有关。

1.2.5 复合提取法

许多学者在实际提取胶原蛋白时,为了提高胶原蛋白提取率、提高提取速度或者保留胶原的某种特性同时简化提取过程等,采用多种方法复合提取,如酸酶复合法、酶与热水复合法、酶酶复合法等,也会加入超声波辅助提取(Ultrasonic-assisted extraction,UAE)、均质化辅助提取(Homogenization)、挤压等处理方法(表1)。

表1 鱼皮胶原蛋白常用的复合提取技术Table 1 Commonly used composite extraction technology for fish skin collagen

1.2.6 常规提取方法的比较

表2 对比分析了鱼皮胶原蛋白4 种常规提取方法的优缺点。在胶原蛋白的提取中,酶提是比较有效的提取方法。在实际应用过程中,根据所需产物特性要求,也会选择相应的提取方法,例如即食食品,更青睐热水提取。

表2 鱼皮胶原蛋白不同提取方法的比较Table 2 Comparison of different extraction methods of fish skin collagen

1.3 鱼皮胶原蛋白的分离纯化

胶原蛋白属于大分子蛋白,主要使用盐析、透析、离心、电泳、色谱法和离子交换层析等方法达到分离纯化目的[31]。盐析是最简单、最常用的一种分离手段,盐一般使用NaCl 或(NH4)2SO4,主要包括三种方式,即:加入NaCl 固体、加入高浓度的盐溶液、用高浓度盐溶液透析,通常在不同的等电点和不同的盐浓度下胶原蛋白的溶解度不同,盐析法可以实现不同类型胶原蛋白的分离。因为盐析得到的胶原蛋白纯度不高和胶原蛋白的复杂性,一般一种方法达不到分离纯化的效果,试验过程中需要进一步采用离子交换、高效液相等色谱技术几种方法联合使用和达到分离纯化,获得精制胶原蛋白的目的[32]。根据所需产物的特性性质,选用特定的纯化方法或者利用粗提取液制作产品。

1.4 鱼皮胶原蛋白的脱腥

从猪、牛皮骨等中提取的陆生性胶原蛋白通常无异味,从鱼皮、鱼鳞中提取的胶原蛋白,因为鱼皮中携带的鱼腥味以及提取过程(特别是酶解过程)较难控制,通常使提取液具有不良风味,严重制约鱼皮胶原蛋白在功能性食品方面的开发及应用[33],故在制备胶原蛋白提取液时需考虑脱腥,尤其是直接利用粗提液时。常用的脱腥方法包括物理、化学和生物三种方法[34],物理方法包括通过添加呈味物质的掩盖法、利用环糊精分子的环状结构的包埋法、利用活性炭等吸附剂的吸附法、微胶囊法和减压蒸馏法等[35-36];化学方法包括酸碱处理法、有机溶剂处理、抗氧化剂法、臭氧处理法,利用乙醇、碳酸氢钠、柠檬酸、茶叶中的茶多酚[37]等对原材料进行浸泡去腥后提取,也有研究应用美拉德反应脱除酶解液腥味[38];生物方法是通过利用微生物本身新陈代谢产物的掩盖作用或者使腥味物质和微生物产生反应生成无腥味物质来达到脱腥效果[39]。经过脱腥效果得到酶提液、酸提液、水提液等粗提液。根据所需产物特性进行相应处理,尤其在利用鱼皮副产物提取胶原蛋白制作鱼冻等可食用食品时,采用无害快速有效的去腥方法是值得研究的一个问题。

2 胶原蛋白在食品中的应用

在食品领域,胶原蛋白具有低免疫原性、成膜性好、良好生物相容性等,使胶原蛋白在保健食品、食品添加剂、食品包装中得到很好的应用。

2.1 胶原蛋白在保健食品中的应用

补钙,增强钙吸收能力。胶原蛋白中含有赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和组氨酸等必需的氨基酸,其中胶原蛋白特征氨基酸羟脯氨酸有将血浆中的钙运输到骨细胞的作用,羟脯氨酸越多,钙的补充速度越快。Mizuno 等[40]研究发现,骨髓细胞是多能细胞,骨髓细胞在I 型胶原蛋白凝胶培养时,显示出较高的活性,说明I 型胶原蛋白能诱导骨髓细胞成骨细胞分化。Yuan 等[41]研究了用酶水解得到胶原蛋白之后,发现胶原蛋白具有高的钙结合性,主要是因为氨基的氮和羧基的氧是Ca2+的主要结合位点。

预防疾病,增强免疫力。王毅虎等[42]给小鼠喂食胶原粉30 d 后对其进行测试,结果表明,所用的胶原粉能显著提高小鼠的免疫力。耿黎明等[43]把高胆固醇患者分成2 组,每组60 人,分别口服胶原蛋白和辛伐他汀,结果表明,胶原蛋白能辅助提高药物降血脂的作用。并可补充体内某些缺乏的必需微量元素,从而使其维持在一个相对正常的范围内,是一种理想的减肥降血脂食品[44]。此外,Rafat[45]开发了胶原蛋白-壳聚糖复合水凝胶作为角膜植入,研究显示胶原蛋白能够提高角膜上皮细胞的修复能力和加速细胞生长。胶原蛋白还有加速血红蛋白和红细胞生成的功能,改善循环,有利于防治冠心病、缺血性脑病[44]。

在其他特殊保健方面。尹利端等[46]研究表明,胶原蛋白有很强的皮肤锁水功能,且对人体健康无害;胶原蛋白还具有抑制胃酸和胃原酶的分泌,减轻由胃酸分泌过多带来的不适[47],减轻胃溃疡患者的疼痛感,促进胃溃疡愈合[48]。据报道,胶原蛋白可协助机体排出铝元素,减少铝在体内的聚积,从而降低某些疾病(如老年痴呆症)的发生概率[49]。

2.2 胶原蛋白在食品添加剂中的应用

胶原蛋白作为食品添加剂,既能提高食品的品质,又能补充部分氨基酸(表3)。除了添加少量胶原蛋白,还可使用胶原蛋白提取液制作食品。如李江明等[50]将罗非鱼鱼鳞胶原蛋白提取液与菠萝果汁混合,得到了一种营养丰富的胶原蛋白果味饮料。易翠平等[51]以鳡鱼副产物为原料,采用提取、调味、成型等工艺开发出营养与风味俱佳的鱼冻产品。

表3 胶原蛋白在食品添加剂中的应用Table 3 Application of collagen in food additives

2.3 胶原蛋白在食品包装中的应用

胶原蛋白材料具有很强的韧性和优良的成膜能力,用做香肠、肉类、鱼类等的包装材料。明胶制成的生物降解膜(可食包装膜)拥有很好的性能,可以用于保鲜、食品包装或直接食用,典型的可食膜是人工肠衣[58],胶原肠衣和肉制品收缩率一致且能固定化酶用于改善食品风味和质量。Fadini 等[59]用水解胶原蛋白和可可油在蔗糖塑化条件下制备的可食包装膜,高浓度的水解胶原蛋白产生的薄膜使得更加均匀,起良好的包装作用。樊世芳等[60]混合明胶、壳聚糖、蛋白肽后制成膜涂在鲫鱼鱼片表面,显示这种涂膜剂能延长鱼片在4 ℃环境下冷藏的货架期,因为胶原包装时很好的阻气、阻油、阻湿等良好特性,减少氧化反应的产生和抑制美拉德反应。

3 结论与展望

制备胶原蛋白过程中,不同提取方法具有不同提取效果,得到的胶原蛋白也存在特性差异。热水提取法所得胶原凝胶特性最好;酶法提取效果最佳,采用此法提取胶原蛋白成为近几年的研究热点,不过酶切位点的不确定性是研究的难点。在研究中也不断涌现新型提取工艺,多种常规方法复合、超声波辅助等。另外,胶原蛋白因其特性应用十分广泛,有很高的研究价值,但在市场上有不少商家夸大胶原蛋白功效借机谋取暴利。同时研究发现,从鱼皮中提取的胶原蛋白应用在食品中有腥味,对热敏感,加热时易发生热变性,三螺旋结构被破坏,其特性随之改变。

因此,胶原蛋白的未来研究可着眼于以下6个方面:(1)提高胶原蛋白的应用潜力,明确胶原蛋白对人体的功效及产生功效的机理,从人体细胞学、代谢组学和预防医学的角度入手,致力于研发出鱼皮等副产物的高性价比产品;(2)目前,胶原蛋白的称谓界定不明确,同时胶原蛋白的提取过程、提取率计算有待标准化,从参考文献看出,不同计算方法下的提取率不具备可比性;(3)提高鱼皮胶原蛋白提取分离纯化技术和减短提取时间,增加产量,深入研究胶原蛋白肽,基于水产品胶原蛋白热稳定差的研究基础上,如何增加保护机制,减少温度的限制;(5)在提取鱼皮胶原蛋白过程中,建立对提取液有效脱腥的方法;(6)完善胶原蛋白结构指纹图谱,为胶原蛋白生产提供有效依据。