地耳草总黄酮提取工艺优化与含量测定

吴 冰，莫婷婷，陆梅元，曾 超，赵凤仙

（1.柳州市中医医院，广西 柳州 545001；2.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023；3.广西壮族自治区食品药品审评查验中心，南宁 530029）

地耳草是藤黄科金丝桃属地耳草（Hypericum ja⁃ponicumThumb.）的全草，具有保护肝脏、提高免疫、抗肿瘤等功效［1，2］。地耳草肿瘤抑制作用是其重要的研究方向，其提取物对前列腺癌、结肠癌细胞以及白血病有抑制作用［3］。地耳草主要含有黄酮类、间苯三酚衍生物和吡喃酮类化学成分［2，4，5］。

现代研究表明［6-8］，黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、降血脂改善心肌供血等作用［9］，还具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗感染和抗病毒等药理作用［10-12］。目前，国内对地耳草总黄酮含量测定的相关研究较少，为保证其药材质量及临床疗效，本试验建立了地耳草总黄酮的含量测定方法，为建立地耳草药材的质量标准提供科学依据。研究将同时对12 批不同产地的地耳草进行总黄酮含量测定，为地耳草药材的质量评价提供一定的参考价值，也为研究地耳草药材的质量控制新方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试药

芦丁（批号：195106），纯度>98%，购于上海融禾医药科技有限公司；其余试验所用试剂均为分析纯。药材来源见表1，经广西中医药大学第一附属医院药学部副主任中药师曾超鉴定为藤黄科金丝桃属地耳草的全草，经54 ℃烘干，备用。

表1 不同产地地耳草样品的来源

1.2 仪器

UV1780 型紫外-可见分光光度计，岛津公司；XS105D 十万分之一天平，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司；KQ5200B 超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；DFT-1000 高速万能打粉机，温岭市林大机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品6.32 mg，加65%乙醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，摇匀，制成浓度为0.252 8 mg/mL的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液制备 取药材粉末约1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加75%乙醇30 mL 称定重量，回流提取0.5 h，再称定重量，用65%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液1 mL 置25 mL 容量瓶中，即得供试品溶液。

1.3.3 线性方程的制定 分别取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，加5%亚硝酸钠0.4 mL，放置6 min 后，加10%硝酸铝0.4 mL，放置6 min，再加4%氢氧化钠4 mL，加水至刻度，摇匀，放置10 min，然后在510 nm 测定吸光度［13］。

1.3.4 单因素试验 分别考察提取方法、乙醇体积分数、提取体积、提取时间对总黄酮提取率的影响。

1.3.5 正交试验设计 地耳草中提取总黄酮的方法主要有有机溶剂提取法。根据查阅的相关文献和《中国药典》2015 年版［14，15］，试验最终采取乙醇为溶剂进行提取，根据单因素考察结果分析，设置乙醇体积分数（65%、75%、85%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40）（g/mL）、提取时间（0.5、1.0、1.5）设计L9（34）正交试验（表2），使用紫外-可见分光光度计测定地耳草总黄酮含量。

表2 L9（34）正交试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 线性方程

以吸光度对浓度做线性方程，方程为y=8.697 2x-0.006 5，R2=0.999 2，在 0.012 6～0.101 1 mg/mL 浓度与吸光度有良好的线性关系。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 精密称取广西富川县产的地耳草药材粉末约1.0 g 制备供试品溶液，于510 nm 波长处连续6 次测定其吸光度，结果RSD为1.02%，表明该方法精密度良好。

2.2.2 稳定性试验 精密称取广西富川县产的地耳草药材粉末约1.0 g 制备供试品溶液，于510 nm 波长处分别在0、20、40、60、80、100、120 min 测定吸光度，计算药材的RSD值为2.15%，表明吸光度在120 min内基本不变，样品在120 min 内稳定。

2.2.3 重复性试验 精密称取广西富川县产的地耳草药材样品6 份，每份药材粉末约1.0 g 制备供试品溶液，于510 nm 波长处平行测定其吸光度，计算地耳草药材的平均含量为31.28 mg/g，RSD值为2.56%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验 称取地耳草茎药材粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，精密加入芦丁对照品溶液15.64 mg 制备供试品溶液，于510 nm 波长处平行测定其吸光度，计算总黄酮的含量（表3）。由表3 可知，平均回收率为99.61%，RSD值为2.43%（n=6），表明该方法回收率良好。

表3 加样回收率试验（n=6）

2.3 单因素考察

2.3.1 提取方法的考察 取广西富川县的地耳草药材粉末约1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，提取时间1 h、30 mL、65%乙醇为提取条件，分别采用超声提取法、回流提取法和浸渍法对药材进行总黄酮提取。结果表明，回流提取法的提取率最高，故而选择回流提取（图1）。

图1 提取方法对总黄酮提取率的影响

2.3.2 乙醇体积分数的考察 取药材粉末约1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，采用回流提取法提取时间1 h，以30 mL 35%、45%、55%、65%、75%和85%乙醇对药材总黄酮提取率做单因素试验，结果表明，75%乙醇回流提取地耳草药材总黄酮的提取率最高（图2）。

图2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

2.3.3 提取体积的考察 取药材粉末约1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，采用回流提取法提取时间1 h，以 10、20、30、40、50 和 60 mL 75% 乙醇对药材总黄酮提取率做单因素试验，结果表明，提取体积为30 mL 的提取率最高（图3）。

图3 提取体积对总黄酮提取率的影响

2.3.4 提取时间考察 取药材粉末约1.0 g，精密称定，置锥形瓶中，采用回流提取法以75%乙醇30 mL，考察提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 对药材总黄酮提取率的影响，结果表明，提取时间为1.0 h 的提取率最高（图4）。

图4 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.4 正交试验结果

根据正交设计助手软件、试验方差分析结果可知，乙醇体积分数对总黄酮的提取工艺有显著性影响，而提取体积和提取时间无显著性差异，且各影响因素的强弱为乙醇体积分数（A）>料液比（B）>提取时间（C），对地耳草总黄酮含量有统计学意义的因素是乙醇体积分数，提取体积和提取时间没有显著性意义，因此最理想的提取方案是A2B2C2，即75%乙醇、料液比1∶30、回流提取1.0 h 提取效果最佳（图5）。

2.5 样品含量测定

精密称取每个产地的地耳草药材粉末3 份，每份约1.0 g，置锥形瓶中制备供试品溶液，测定总黄酮含量，结果见表6。

表4 正交试验结果

表5 正交试验方差分析

表6 不同产地的地耳草药材总黄酮含量测定结果

3 小结与讨论

试验以地耳草为研究对象，考察了乙醇体积分数、提取体积和提取时间3 个影响因素，采用回流提取法，利用正交试验方法来优选地耳草总黄酮的最佳提取工艺，确定影响地耳草总黄酮提取工艺的主要因素是溶剂体积分数、提取体积和提取时间等。地耳草的最佳提取工艺为回流提取，乙醇体积分数为75%，料液比1∶30，提取1.0 h。

在相同试验条件下，加入同体积、同体积分数的乙醇可能会出现提取率不一致的状况。具体原因可能是由于地耳草药材粉末接触乙醇的溶剂面积不一样。但是在加入相同质量地耳草的情况下，加入乙醇的量越多，提取率越高，呈正相关关系。除此之外，还可以考察更多的因素，如提取温度、提取溶剂、溶剂pH 和提取次数等，且每个因素也可以通过单因素试验确定更好的试验水平，再通过正交试验优选出提取率更佳的方案。

不同产地地耳草中总黄酮含量差异较大，广西富川县产的地耳草总黄酮含量最高，其次是广西贺州市和广西昭平县，而广西合浦县和广西北海市产的地耳草总黄酮含量较低。可能是由于不同地域、不同气候、不同土壤以及不同的采摘季节影响而产生的结果。

地耳草自然资源丰富，在临床中应用广泛。通过查阅相关文献发现，目前对地耳草总黄酮的研究还较少，为保障其临床用药合理、安全、有效，本研究通过正交试验筛选出地耳草总黄酮的最佳提取工艺，为进一步研究、开发地耳草的药用资源提供科学依据。