土壤中重金属铜胁迫对润草1 号生化指标的影响

张 丽，赵忠涛，顾 静

（江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400）

近年来，由铜、铅等重金属所造成的农业环境污染变得越来越严重。重金属进入土壤后难以被生物降解，除了不可逆转和长期性外，其隐蔽性和潜伏性更强，从而使净化和修复受污染的土壤变得很困难。因此，人类的生存环境和生态环境的健康发展严重地受到了重金属污染的影响［1］。

重金属铜是植物生长必不可少的重要微量元素，它是某些氧化还原酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、细胞色素氧化酶和蛋白质的关键组成成分。因此，铜较大地影响着发生在植物体内的氧化还原过程。在植物的叶绿体中铜也广泛存在，其主要作用是参与植物的光合作用［2］。在农业生产中，铜盐还是一种重要的农药和杀菌剂，在植物的生长发育中起着重要的作用。在正常情况下，植物对铜的吸收主要是通过受代谢控制的主动吸收过程来实现。但是，当土壤中重金属铜浓度超过一定值时，会对植物产生一定的毒性和负面影响。轻则使植物的新陈代谢过程受到干扰，将阻止植物的正常生长和发育，重则会导致植物的老化和凋亡。土壤中重金属铜造成的污染可以通过使用草坪进行修复，这样土壤不仅可以得到净化，而且对人类的生产条件和生活环境也有着有益的影响［3］。为此，本研究通过分析不同浓度铜对润草1 号生化指标的影响，以期为制定中国重金属污染地区土壤中重金属铜的含量标准，以及为开发利用润草1 号修复被重金属铜污染的土壤、草坪绿地建设和规划提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的材料为润草1 号，是中国广泛栽培的一种早熟禾品种，由镇江润祥园林科技发展有限公司培育及提供。选用经过烘干灭菌后的3～5 mm 直径的细沙为培养基质。重金属铜添加形式为 CuSO4·5H2O，分析纯。

1.2 试验设计

将沙子过 5 mm 目筛后，用 2%（V/V）HNO3溶液浸泡过夜，并用去离子水洗净，然后洗净的沙子放在托盘里置于干燥箱中，在105 ℃条件下烘干1 h 灭菌，再在80 ℃条件下烘干约3 h 至恒重。分别称重6 kg沙子，装入25个塑料花盆，所用花盆的上口直径为25.8 cm、下口直径为16.3 cm、高为22.5 cm。试验时，以不添加重金属铜的处理方法作为对照，并将重金属铜的胁迫浓度设定为5、10、20、50、100 mg/kg（以Cu2+计量重金属铜的胁迫浓度），每处理重复4 次。

根据预设的重金属铜的胁迫浓度，在每个花盆中添加5 种不同浓度的重金属铜溶液各1 000 mL。每天喷施适量的去离子水，使每个花盆的重量保持不变。平衡2 周后，在每个花盆中添加Hoagland 营养液20 mL。润草1 号种子在去离子水中浸泡24 h后，再在每个花盆中播种300 粒。每天继续喷施适量的去离子水，以确保每个花盆的重量保持不变。室温25 ℃左右培养，每日光照8 h，全天通气。种植1 个月后，分别取样分析。

1.3 测定方法

采用考马斯亮蓝法测定润草1 号叶片中总蛋白质的含量；采用蒽酮法测定润草1 号叶片中可溶性糖的含量；润草1 号叶片中SOD 的活性和POD 的活性采用试剂盒法测定。测定时所使用的主要仪器是UV-2100 紫外/可见分光光度计。

2 结果与分析

2.1 重金属铜胁迫对润草1 号叶片中总蛋白质含量的影响

在植物体内的可溶性蛋白质主要是各种代谢酶，其含量高低反映了细胞在植物体内的整体代谢能力［4］，在某种程度上也反映了植物的生长潜力。当重金属离子进入植物体时，会与其他化合物结合成螯合物或者生成络合物，从而抑制了植物的新陈代谢，特别是影响蛋白质合成。因此，可溶性蛋白质的含量是植物是否受到重金属胁迫的一个重要指标［5］。从图1 可以看出，经铜处理后，润草 1 号叶片中可溶性蛋白质含量发生了显著的变化。随着铜浓度的增大，可溶性蛋白质的含量先上升，随后下降。铜浓度为10 mg/kg 时，可溶性蛋白质含量达到最大值。

图1 不同浓度铜胁迫对润草1号叶片中总蛋白质含量的影响

2.2 重金属铜胁迫对润草1 号叶片中可溶性糖含量的影响

可溶性糖是植物体内重要的有机物之一，也是植物碳和能量的重要来源。为了适应干旱、低温、重金属等逆境条件，植物会积极积累一些可溶性糖，以提高自身的渗透调节能力和降低冰点。可溶性糖是植物在逆境中产生的适应性产物，因此有利于增强植物的抗逆性［6］。从图2 可以看出，铜处理后，润草1 号叶片中可溶性总糖含量发生了明显的变化，随着铜浓度的增大先升高后降低。铜浓度为20 mg/kg时，可溶性总糖含量达到最大值。

图2 不同浓度铜胁迫对润草1号叶片中可溶性糖含量的影响

2.3 重金属铜胁迫对润草1 号叶片中SOD 活性的影响

超氧化物歧化酶（SOD）是植物体内最重要的自由基清除酶，它的主要生理功能是消除植物体内广泛存在的超氧阴离子自由基（），使·转变成没有毒性的氧气和毒性比较低的过氧化氢，并减少具有较大毒性和较高活性的·OH 的生成，从而使植物体内存在的自由基保持在较低的水平，以减轻·对植物的伤害［7］。SOD 的活性水平与植物的抗逆性密切相关。在面对中等强度的逆境时，SOD 的活性增强是为了有效提高植物抵抗逆境的能力，从而使植物能够适应逆境而存活下来。植物能够成功地抵抗逆境胁迫的生理基础就是具有较高的SOD 活性。从图3 可以看出，铜处理后，随着铜浓度的增大，润草1号叶片中SOD活性表现为先上升后下降，发生了显著的变化。铜浓度为50 mg/kg 时，SOD 活性达到最大值。

图3 不同浓度铜胁迫对润草1 号叶片中SOD 活性的影响

2.4 重金属铜胁迫对润草1 号叶片中POD 活性的影响

过氧化物酶（POD）在植物的各种组织中广泛存在，其活性较高，与植物的光吸收、光氧化等有关［8］。POD 主要生理功能是消除分子氧在代谢过程中产生的过氧化氢和其他过氧化物，使自由基保持在较低水平，从而避免自由基对植物的伤害［9］，在植物的抗氧化代谢过程中起着非常重要的作用。POD 是一种更有效的适应性酶，反映植物生长、内部代谢和适应外部环境的能力。植物在重金属的胁迫下，各种组织中广泛存在的POD 活性表现出明显的升高或降低。从图4 可以看出，铜处理后，润草1 号叶片中POD 活性发生了显著的变化，随着铜浓度的增大表现为先上升后下降的趋势。铜浓度为20 mg/kg时，POD 活性达到最大值。

图4 不同浓度铜胁迫对润草1 号叶片中POD 活性的影响

3 小结与讨论

糖是小分子物质，在植物受到渗透胁迫时起到重要的调节作用，脯氨酸在植物体内积累时也需要糖的参与。糖具有较强的氧化还原能力，脯氨酸合成时所必需的氧化还原能力就是糖通过氧化磷酸化提供的，它是植物进行新陈代谢所必需的基础物质［10］。试验结果表明，润草1 号叶片中可溶性糖含量对重金属铜的胁迫非常敏感。铜浓度较低时，可溶性糖含量略有增加，可能是润草1 号叶片内不溶性糖（如淀粉、纤维素等）发生了降解引起的，也可能是光合作用产生的淀粉在运输过程中受到了阻碍的结果，还有可能是葡萄糖酶和蔗糖酶的活性在代谢过程中出现了反常所引起的［11］。铜浓度较高时，可溶性糖的含量大幅下降，可能是润草1 号叶片中进行光合作用的整个系统受到了铜的破坏，造成了叶片内不溶性糖发生分解且不能进行正常的运输［11］；也可能是高浓度铜胁迫下，降低了润草1 号叶片的含水量，使叶片内积累的可溶性糖通过渗透调节作用避免细胞受到伤害。

蛋白质是生物体进行生命活动必不可少的基础物质，生物体内细胞代谢酶的变化情况可以通过可溶性蛋白质含量来反映。试验结果表明，随着铜胁迫浓度的增加，润草1 号叶片内可溶性蛋白质含量呈现出先升高后降低的变化趋势。铜浓度较低时，为了减轻铜胁迫造成的伤害，润草1 号叶片以蛋白质的合成为主，因此蛋白质含量升高。随着铜浓度的增大，润草1 号叶片的细胞结构被破坏，阻碍了蛋白质的合成，加快了原有蛋白质的分解，导致细胞代谢酶和可溶性蛋白质受到破坏，使润草1 号叶片内可溶性蛋白质含量出现了不同程度的下降。

自由基的产生和清除是植物细胞内进行的两个相反过程，只有在各种保护酶协同作用下才能清除产生的自由基，使植物细胞免受自由基的伤害［12］。重金属铜胁迫下，润草1 号叶片内各种保护酶活性也发生相应的改变，但因胁迫浓度的不同而有所不同。试验结果表明，随着铜胁迫浓度的增大，润草1号叶片内SOD 的活性先升高后降低。在低浓度铜胁迫下，润草1 号叶片细胞内自由基产生的比较少，SOD 的活性变化也比较小。随铜胁迫浓度的增大，润草1 号叶片内则产生大量的氧自由基使其浓度迅速增加，SOD 活性也相应地增大以歧化活性氧，胁迫下SOD 活性的增大还可能与酶蛋白的大量合成有关［13］，使润草1 号表现出较强的抗氧化和抗损伤的能力。但当产生的自由基大于SOD 清除能力时，SOD 活性也会受到自由基的影响，其活性大幅下降甚至完全失去活性，同时其他代谢酶也会受到自由基的伤害，甚至引起润草1 号的凋亡。因此，在重金属铜胁迫下，高的SOD 活性对维持润草1 号对氧化损伤的整体防御能力具有重要的作用。

活性氧和自由基具有很强的毒害作用，只有保持其产生与清除的平衡，才能使细胞膜系统免受损伤。抗氧化剂和保护酶对平衡起着调节与控制作用，若平衡被破坏会使脂膜的过氧化作用加剧，对细胞膜系统造成破坏［14］。POD 能清除活性氧和自由基，是植物在逆境胁迫下的重要保护酶类。当润草1 号叶片受铜胁迫后，叶片内POD 活性随着铜胁迫浓度的增大，先应激性升高然后降低，在铜胁迫浓度为20 mg/kg 时润草1 号叶片内POD 活性出现高峰值。POD 活性升高的原因可能是由于铜胁迫浓度小于20 mg/kg 时，润草1 号叶片内有大量的活性氧（如·、·OH、H2O2等）累积，这些活性氧不但使脂膜的过氧化作用增强，也使POD 活性升高，从而减轻了活性氧对脂膜的伤害。当铜胁迫浓度大于20 mg/kg时，润草1 号叶片受到较大伤害防御能力下降，不能将产生的活性氧及时除去而生成毒性更大的·OH 自由基，对脂膜造成不可逆转的伤害，使润草1 号叶片结构遭到破坏；也对POD 造成伤害活性急剧下降，使其清除活性氧的能力降低，加剧了脂膜的氧化及结构和功能的破坏，导致润草1 号的生理代谢紊乱并加速其凋亡，这也是铜毒害润草1 号的主要原因。