外源5-氨基乙酰丙酸对干旱胁迫下黄瓜种子萌发及幼苗生长的影响

邓硕真，刘惠军，王洪芹，王红艳，张倩茹，张 梅

（中国农业大学烟台研究院，山东 烟台 264670）

中国具有水资源短缺、分布不均衡、过分利用从而导致大量浪费等问题，目前大面积土地处于干旱和半干旱区域，水资源的不足严重抑制了农业的生产和发展。在干旱环境下，植物细胞的膨压下降、叶片萎蔫下垂，在极度干旱的环境下，植物细胞严重脱水，体内各个生理生化反应混乱失调，严重的情况下则会促使植物死亡［1］。中国粮食和蔬果的产量和质量深受干旱条件制约。黄瓜（Cucumis sativusL.）属于中国普遍种植的蔬菜种类，因其鲜嫩多汁、富含养分而深受人们喜爱，栽种面积大、分布广。但是黄瓜是浅根性作物，面对环境的水分变化敏感度高，整个生命周期大量需水，抵御干旱的能力不足。因此探索具有提高黄瓜抗旱性功能的外源生长物质具有重要意义。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）又名δ-氨基乙酰丙酸，是一种非蛋白氨基酸，广泛分布于动植物机体活细胞中，是合成叶绿素、血红素和维生素B12等四吡咯环色素的必要前体物质，在生物体的多种生物化学反应发挥重要作用［2］。前人试验发现，5-ALA 具有提高菠菜幼苗抗氧化酶活性［3］；提高叶绿素b 含量从而稳定LHCⅡ脱辅基蛋白结构［4］；促进盐胁迫下酸枣种子萌发［5］；促进愈伤组织不定根不定芽分化［6］；提高棉花［7］、草莓［8］等多种植物的抗盐性以及提高甜瓜［9］、黄瓜［10］等瓜类抗冷性的功效，是一种杰出的外源植物生长调节剂，被普遍应用于农业环境调控研究。但是有关5-ALA 提高植物抗旱性的探究较少。PEG-6000（聚乙二醇）是一种理想的高分子渗透剂，渗透压稳定，限制植物水分吸收速率，可以用于干旱缺水环境的模拟。

为此，以津耘五号黄瓜种子及幼苗作为试验材料，采用20% PEG-6000 进行根灌处理，不同浓度的5-ALA 进行叶面喷施处理，探索5-ALA 对干旱胁迫下黄瓜种子的萌发及黄瓜幼苗的生长发育是否具有缓解作用，并确定效果最明显的5-ALA 浓度，以期为黄瓜的种植栽培提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的黄瓜种子为津耘五号，购自天津子丰种业有限公司，5-ALA 由山东深海生物科技股份有限公司提供，现用现配。PEG-6000 的浓度为20%（由预试验确定）。

1.2 种子萌发生理指标测定

选取大小均一、颗粒饱满、完整无破损的黄瓜种子 1 050 粒，经过0.1%（W/V）HgCl2消毒15 min 后，反复清洗直至除去残留。将种子投入55～60 ℃的温水处理10～15 min，用玻璃棒搅拌，待水温降到20～30 ℃，将其放置在25 ℃恒温箱内浸种4～6 h。浸种后的种子随机分为7 组，培养在直径为9 cm，内铺一层滤纸的培养皿中。每组3 个培养皿，各有黄瓜种子50 粒，以此作为3 次重复。试验组设置为双蒸馏水空白对照（T0）、20% PEG-6000 处理（T1）以及在T1 基础上分别加入 0.05 mg/L（T2）、0.5 mg/L（T3）、1.0 mg/L（T4）、5.0 mg/L（T5）、10.0 mg/L（T6）的5-ALA。将培养皿置于25 ℃培养箱中培养3 d，每天更换溶液，并保持空气畅通，记录发芽种子数，第3 天量取发芽种子芽长度，并计数全部芽长大于2 mm 的黄瓜种子。测量记录后计算种子的发芽率（Gr）、发芽指数（Gi）和活力指数（Vi），计算公式如下：

发芽率（Gr）=（3 d 内发芽的种子数/试验种子总数）×100%

发芽指数（Gi）=ΣGt/Dt

式中，ΣGt为第3 天发芽数，Dt为发芽天数。

活力指数（Vi）=Gi×S

式中，S为第3 天幼根平均长度。

1.3 幼苗生理指标测定

选取饱满、大小一致的黄瓜种子于55～60 ℃的温水浸种后，放置于25 ℃恒温箱中催芽至露白，播于32 孔穴盘中，定期定量灌溉。待幼苗长至两叶一心时，选取长势相同的黄瓜幼苗移栽至盆中，分为7个试验组，每组24 株，3 次重复。试验组设置为双蒸馏水空白对照（T0）、20% PEG-6000 处理（T1）以及在T1基础上分别加入0.05 mg/L（T2）、0.5 mg/L（T3）、1.0 mg/L（T4）、5.0 mg/L（T5）、10.0 mg/L（T6）的5-ALA。缓苗后，向幼苗根灌20% PEG-6000溶液1次，浇透为止。7 d后，傍晚向幼苗叶片喷施5-ALA溶液，叶片反面滴水为限，每3 d 喷施一次，处理后12 d 取样测定，测定的生理指标包括黄瓜幼苗的株高、茎粗、根冠比、干重、壮苗指数、根系活力、可溶性糖含量、游离脯氨酸含量及光合色素含量。

1.3.1 幼苗生长指标测定 将幼苗在营养土中挖出，用去离子水洗净植株，将地上和地下部分分离，擦干。量取植株茎底部到生长点的间隔，记为株高，量取地上部1 cm 处茎粗。将样品于105 ℃下烘干至恒重，用分析天平称量其干重。计算壮苗指数的公式为：

壮苗指数=（地下部干重/地上部干重+茎粗/株高）×全株干重

1.3.2 幼苗生理指标测定 黄瓜幼苗游离脯氨酸含量测定采用水合茚三酮法［11］，用 μg/g FW 表示其含量，使用紫外分光光度计进行比色。可溶性糖含量采用蒽酮法［11］测定，用紫外分光光度计测其在630 nm 处的吸光度，用mg/g FW 表示含量。根系活力的测定采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法［12］，光合色素含量采用赵世杰等［12］的方法，用80%丙酮提取后比色。

1.4 数据分析

对3 组重复的数据取平均值，用SPSS 18.0 进行方差分析，用LSD法进行多重比较，显著性差异水平为P＜0.05，用Origin 进行图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 不同浓度5-ALA 处理下黄瓜种子的发芽指标

由表1 可知，20% PEG-6000 处理下黄瓜种子萌发受到严重抑制，黄瓜种子发芽率、发芽指数、活力指数均处于最低水平。随着5-ALA 浓度的提高，黄瓜种子发芽率、发芽指数、活力指数首先呈上升趋势，当5-ALA 浓度达到0.5 mg/L 时，发芽率、发芽指数、活力指数均达到最大值。发芽率为92.3%，相对于T1（干旱处理）黄瓜种子发芽率（59.7%）提高了32.6个百分点，与T0（蒸馏水）处理发芽率（92.1%）无显著差异；发芽指数为15.39，相对于T1（干旱处理）黄瓜种子发芽指数（9.94）提高了54.83%，与T0（蒸馏水）处理黄瓜种子发芽指数（15.35）无显著差异；活力指数为74.47，是T1（干旱处理）活力指数（10.69）的6.97 倍，与T0（蒸馏水）处理黄瓜种子的活力指数（70.82）无显著差异。随着5-ALA 浓度进一步提高，黄瓜种子发芽率、发芽指数、活力指数均明显出现下降趋势，当 5-ALA 浓度为 10.0 mg/L（T6）时，黄瓜种子活力指数（19.61）与T1（干旱处理）无显著差异，说明不同浓度的5-ALA 能够缓解干旱胁迫对黄瓜种子萌发的限制作用，在试验处理中，0.5 mg/L 5-ALA效果最好，过高浓度的5-ALA 对干旱胁迫下黄瓜种子发芽的促进作用反而不明显。

表1 不同浓度5-ALA 处理下黄瓜种子发芽指标

2.2 不同浓度5-ALA 处理下黄瓜幼苗的生长指标

在干旱缺水条件下，植物一般通过形态上的变化来顺应外部环境。由表2 可知，叶面喷施5-ALA明显缓解了干旱环境对黄瓜幼苗生长发育的抑制，随着5-ALA 浓度的升高，黄瓜幼苗的株高、茎粗、根冠比、干重、壮苗指数首先呈上升趋势。其中T3（0.5 mg/L）的缓解效果最好，株高、茎粗、根冠比、干重和壮苗指数相对于T1（干旱处理）分别提高了43.08%、37.41%、30%、99.13%和104.51%，与T0（蒸馏水）处理无显著差异。随着5-ALA 浓度的继续提高，各指标明显出现下降走势。当5-ALA 浓度为10.0 mg/L（T6）时，黄瓜幼苗的茎粗、根冠比、干重及壮苗指数与T1（干旱处理）无显著差异，说明高浓度的5-ALA 对黄瓜植株的生长发育和形态建成的促进效果不明显。

表2 不同浓度5-ALA 对黄瓜幼苗生长的影响

2.3 不同浓度5-ALA 对黄瓜幼苗渗透调节物质含量的影响

游离脯氨酸和可溶性糖在植物细胞内发挥渗透调节的作用，其含量和植物抗旱性呈正相关。如表3 所示，T1（干旱处理）下，黄瓜植株游离脯氨酸含量和可溶性糖含量均明显高于T0（蒸馏水）处理，表明黄瓜幼苗此时处于渗透胁迫中。随着5-ALA 浓度的提高，黄瓜幼苗体内游离脯氨酸和可溶性糖含量均呈现先上升后下降的趋势。当5-ALA 浓度为0.5 mg/L 时，黄瓜幼苗体内的游离脯氨酸和可溶性糖含量到达最大值，此时游离脯氨酸含量为65.26 μg/g FW，相对于T1（干旱处理）下游离脯氨酸含量（24.77 μg/g FW）提高了163.46%；此时可溶性糖含量为60.40 mg/g FW，相对于T1（干旱处理）下可溶性糖含量（42.90 mg/g FW）提高了40.79%。当用10.0 mg/L（T6）的5-ALA 处理黄瓜幼苗时，其可溶性糖和游离脯氨酸含量都明显低于T3（0.5 mg/L）处理，此时可溶性糖含量与T1（干旱处理）无显著差异，说明不同浓度的5-ALA 能够提高干旱条件下黄瓜植株体内渗透调节物质的含量，从而增强其抵御干旱的能力。在本试验处理中，0.5 mg/L 5-ALA 效果最好，过高浓度的5-ALA 对黄瓜幼苗抗旱性提高的效果反而不明显。

表3 不同浓度5-ALA对黄瓜幼苗渗透调节物质含量的影响

2.4 不同浓度5-ALA 处理下黄瓜幼苗的根系活力

植物根系是直接吸水器官，最先感受干旱胁迫，并立即启动一连串抗旱响应机制，根系活力的高低也会受到影响［13］。由图1 可知，在干旱胁迫下，随着5-ALA 浓度的提高，黄瓜幼苗根系活力逐渐增强，当5-ALA 浓度达到0.5 mg/L 时，根系活力最强，为121.0 μg/g FW·h，相对于 T1（干旱处理）根系活力（71.0 μg/g FW·h）提高了70.42%，与T0（蒸馏水）处理根系活力（129.3 μg/g FW·h）无显著差异。5-ALA浓度进一步提高，黄瓜幼苗根系活力则呈现下降趋势，T6（10.0 mg/L）根系活力（77.7 μg/g FW·h）显著低于T3（0.5 mg/L），与T1（干旱处理）无显著差异。

图1 不同浓度5-ALA 处理下黄瓜幼苗根系活力

2.5 不同浓度5-ALA 处理下黄瓜幼苗的光合色素含量

干旱胁迫会引起叶绿体的解体及光合色素降解，从而阻止光合作用的正常运行。因此光合色素含量表征了植物抗旱能力的强弱。如表4 所示，在干旱环境下，黄瓜幼苗的叶绿素和类胡萝卜素含量最低，随着不同浓度5-ALA 的加入，有了不同程度的提高。0.5 mg/L 5-ALA 处理下，黄瓜幼苗叶绿素和类胡萝卜素含量达到峰值，此时叶绿素含量显著高于T0（蒸馏水）处理，相比T0（蒸馏水）提高了16.55%，相比T1（干旱处理）提高了38.59%；此时类胡萝卜素含量与T0（蒸馏水）无显著差异，相对于T1（干旱处理）提高了126.92%。随着5-ALA 浓度的继续提高，黄瓜幼苗叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐下降。当用 5.0 mg/L（T5）的 5-ALA 处理时，类胡萝卜素含量与T1（干旱处理）无显著差异。

表4 不同浓度5-ALA 对黄瓜幼苗光合色素含量的影响

3 小结与讨论

种子萌发期对环境变化十分敏感，种子的发芽特性决定了其成苗率，进而影响幼苗的生长发育和形态建成，影响果实的产量和品质。本试验表明，经过5-ALA 处理后，黄瓜种子的发芽率、发芽指数和活力指数相对于干旱环境都有不同程度的提高，其中以0.5 mg/L 5-ALA 处理下最高，这与张春平等［14］研究的甘草种子结果相似。

PEG-6000 模拟的干旱环境明显抑制了黄瓜幼苗的生长发育。其株高、茎粗、根冠比、干重、壮苗指数和根系活力等指标均显著低于蒸馏水环境中生长的幼苗。在加入外源5-ALA 后，每项生长指标都有不同程度的增加，说明叶面喷施5-ALA 可以提高幼苗对干旱环境的抵御能力。这与何娟等［15］研究的发现外源5-ALA 可缓解干旱胁迫对香蕉幼苗生长发育的遏制是相似的。随着加入的5-ALA 浓度的提高，其对干旱胁迫的缓解作用呈现先上升后下降的趋势，其中峰值为0.5 mg/L，高浓度的5-ALA 缓解作用反而很低，这与王宏信等［16］的试验结果相似。

可溶性糖和游离脯氨酸属于植物细胞内的渗透调节物质，在干旱条件下会发生累积。它们含量的增加有助于增大细胞液浓度，降低细胞内的水势，增强细胞保水能力［17］，从而维系细胞膨压，促进细胞分裂扩大，避免植物萎蔫；有助于维持气孔运动，促进CO2的吸收，从而保证光合作用正常运行，防止干旱条件下光抑制的发生［18-20］。脯氨酸还具有除去活性氧［21］，防止生物膜破坏的作用；作为无毒害氮源合成叶绿素；与蛋白质结合，增强其溶解性［22］等功能。因此植物体内游离脯氨酸和可溶性糖含量越高，其抵抗干旱的能力也就越强。试验结果显示，在干旱环境下，随着5-ALA 浓度的增加，可溶性糖和游离脯氨酸的含量呈现先上升后下降的趋势，于0.5 mg/L 达到最大值，幼苗的抗旱性也最强。

干旱环境下，植物的气孔导度降低，CO2的不足及酶活性的下降抑制了光合碳同化的进行，进而抑制光合电子传递，降低植物的光饱和点，弱光便会导致光能过剩，从而发生光抑制［23］，产生过氧化物损伤叶绿体膜系统，致使叶绿素和类胡萝卜素降解破坏而含量降低。叶绿素和类胡萝卜素是维持植物正常光合作用的重要物质，它们能够吸收、传递和转化光能，其含量与植物光合强度有直接关系。此外，叶黄素循环具有热耗散、稳定类囊体膜的结构、抑制膜脂过氧化等作用［24］，因此它们在维持光合结构的稳定性、抵御光抑制，维持植物同化生成有机物的能力等方面具有重要作用。在干旱条件下叶绿素含量和类胡萝卜素含量越高，植物抵御光破坏的能力就越强，植物抗旱性也越高。本试验表明在PEG-6000模拟的干旱环境下，5-ALA 的加入提高了幼苗体内叶绿素和类胡萝卜素的含量，其中以0.5 mg/L 效果最佳，高浓度的5-ALA 缓解效果反而下降，两者含量的提高不明显，这与偶春等［25］对栀子幼苗相关研究结果相似。5-ALA 是形成叶绿素的关键前体物质，在一系列酶的作用下合成原叶绿素酸酯，最终形成叶绿素，5-ALA 的合成是植物体中合成叶绿素等四吡咯的限速步骤。相关研究发现［26］，外源喷施5-ALA 可以上调草地早熟禾叶片内胆色素原合成酶、尿卟啉原脱羧酶、原叶绿素酸酯还原酶等与卟啉和叶绿素生物合成有关的催化酶基因表达，增强酶的活性，提高胆色素原、原卟啉IX、原叶绿素酸酯等中间产物的含量，并促进中间产物向下游产物的转化，从而促进叶绿素的合成；同时外源5-ALA 能通过上调内源5-ALA 合成途径相关酶基因的表达，来促进内源5-ALA 的合成，进一步促进叶绿素的合成。因此5-ALA 处理下黄瓜幼苗体内叶绿素含量提高的作用机理可能与之相似。

综上，叶面喷施不同浓度5-ALA 可以不同程度地促进干旱胁迫下黄瓜种子的萌发，促进幼苗体内光合色素含量及渗透调节物质含量的提高，促进生物量的积累从而促进其生长发育和形态建成。其中以0.5 mg/L 处理效果最佳，在此浓度下，黄瓜种子的发芽状况及黄瓜幼苗的各项生长和生理指标均显著高于干旱环境，过高浓度的5-ALA 对植物抗旱能力的提高反而不明显。