四种药用植物内生真菌的分离及抗单胺氧化酶的活性研究

苟文博，杨中铎，周格格

（兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州 730050）

单胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）是一种存在于线粒体外膜的氧化还原酶，通过催化内源性和外源性单胺类物质的代谢，使其失去生理活性，从而控制机体内胺类物质的水平，其抑制剂在临床上可用于抑郁症、帕金森症、阿尔茨海默症的治疗，但是目前临床上应用的单胺氧化酶均具有一定的副作用，因此，寻找新型的、副作用小的天然单胺氧化酶是十分必要的［1］。

内生真菌（Endophytic fungi）是指在生活史的某段时期生活于植物组织内部，对宿主没有造成明显病害症状的真菌。内生真菌在植物中普遍存在，其代谢产物具有结构新颖、活性好的特点，因此备受关注。内生真菌代谢产物已显示出多种生物活性，可用在抗肿瘤、抗病毒、抗菌以及杀虫等方面，在农业和（或）医药业中也具有重要的应用潜力。但截至目前，关于内生真菌抗单胺氧化酶活性筛选的研究报道还不多见。为了得到天然的单胺氧化酶抑制剂，本试验对4 种植物内生真菌及其抗单胺氧化酶活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 所用药材有栓翅卫矛（Euonymus phel⁃lomanus）、甘西鼠尾草（Salvia przewalskii）、刺五加（Acanthopanax senticosus）、黄 海 棠（Hypericum as⁃cyron）4 种新鲜药用植物，采自甘肃省临洮县，由兰州理工大学杨林副教授鉴定。

Wistar 大鼠购自兰州大学实验动物中心。

1.1.2 真菌培养基 PDA 培养基：新鲜马铃薯去皮200 g/L，葡萄糖25 g/L，去离子水1 L。固体培养基加 2% 琼脂，培养基中加入150 μg/mL 青霉素钾和120 μg/mL 硫酸链霉素用以防止细菌污染。

1.1.3 试剂与仪器 琼脂粉（北京索莱宝科技有限公司）、葡萄糖（上海恒生化工有限公司）、乙醇（山东利尔康消毒科技有限公司）、HgCl（2北京化工厂）、注射用青霉素（华北制药集团）、注射用硫酸链霉素（华北制药集团）、电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）、洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械有限公司）、数显电热培养箱（上海博迅实业有限公司）、光学显微镜（Classica）。

1.2 待测样品制备

1.2.1 内生真菌的分离和纯化 取出要分离菌株的药材剪成小段，然后用无菌水将其洗干净，采用组织切块法处理表面消毒好的药材，放入培养基中进行组织培养。选出切口处新长出的菌丝于PDA 培养基上进行反复的划线分离、纯化，最后在斜面上保存。

1.2.2 发酵产物的制备 取菌丝接种于装有400 mL PDA 液体培养基的三角瓶中，28 ℃、120 r/min 摇床培养7 d。发酵液采用乙酸乙酯萃取，浓缩至干，获得提取物浸膏。

1.3 单胺氧化酶活性测定

单胺氧化酶活性的测定参照文献［2］，即采用酶标法测定酶活性。对于提取物，称取2 mg，用50 μL的无水乙醇溶解，pH 7.6 的磷酸缓冲液稀释，得浓度为1 mg/mL 的待测样品，备用。对于单体化合物，配制成300 μg/mL 的待测样品备用。根据下式计算抑制率：抑制率=［（空白组-空白本底）-（样品-样品本底）］/（空白组-空白本底）×100%。所用样品做3 次平行测定，取其平均值，用磷酸异丙烟肼作阳性对照。

1.4 内生真菌的鉴定

首先采用形态学方法进行初步鉴定，观察菌株的菌落颜色、质地、气生菌丝生长情况、基质的颜色以及在光学显微镜下菌落产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子的形态与颜色，参照《真菌鉴定手册》进行初步鉴定。然后用分子生物学的方法对真菌进行序列测定，其中菌株DNA 的提取、ITS 序列的PCR扩增、纯化和测序工作由上海生物工程股份有限公司完成。将所得的ITS 序列与GenBank 中已知菌株的DNA 序列比对，确定真菌菌属。

1.5 化学成分初步分离

将活化好的菌株SJ-2 在50 L 的发酵罐中用40 L PDB 液体培养基进行大批量发酵，室温下连续培养20 d。培养结束后，菌液用等体积乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，浓缩至干，得提取物浸膏15.2 g。浸膏用大孔树脂柱层析，10%、30%、50%、70%、90%乙醇-水体系进行梯度洗脱，通过TLC 色谱法检查合并样品，最终得到了5 个粗组分SJ-2-A、SJ-2SB、SJ-2-C、SJ-2-D、SJ-2-E。

SJ-2-D 组分（3.58 g）干法上样硅胶柱层析分离，用氯仿-甲醇体系（120∶1～10∶1）进行梯度洗脱，通过TLC 色谱法检查合并样品。得到9 个组分（SJ-2-D-1 至 SJ-2-D-9）。

SJ-2-D-2 组分（850 mg）干法上样硅胶柱层析分离，石油醚-丙酮体系（80∶1～20∶1）梯度洗脱，通过TLC 色谱法检查合并样品，得到7 个组分（SJ-2-D-2-A 至 SJ-2-D-2-G）。其中，组分 SJ-2-D-2-C（180 mg）干法上样硅胶柱层析分离，石油醚-丙酮体系（60∶1～20∶1）梯度洗脱，通过 TLC 色谱法检查合并样品，得到化合物 1（10 mg）。

SJ-2-D-3 组分（240 mg），用 4 mL 色谱甲醇溶解，HPLC 分离，77% 甲醇-水为流动相，流速为1.0 mL/min，得到化合物 2（tR=40.39 min，10 mg）。

SJ-2-D-4 组分（280 mg），用 4 mL 色谱甲醇溶解，HPLC 分离，58% 甲醇-水为流动相，流速为1.0 mL/min，得到化合物 3（tR=40.23 min，18 mg）。

2 结果与分析

2.1 不同药用植物组织中内生真菌数量

经过分离纯化后得到20 株内生真菌，其中从黄海棠中得到10 株内生真菌，从刺五加中得到2 株内生真菌，从甘西鼠尾草中得到6 株内生真菌，从栓翅卫矛中得到2 株内生真菌，表明药用植物组织中存在丰富的内生真菌资源。

2.2 内生真菌发酵物的单胺氧化酶抑制活性

通过酶标法测定了所有内生真菌提取物对单胺氧化酶的抑制活性，活性较高的3 种内生真菌提取物为栓翅卫矛（SJ-2）、刺五加（WJ-3）、黄海棠（HJ-1）的PDB 液体培养基菌液提取物（表1）。对抑制率 70% 以上的提取物测定了其IC50，SJ-2、WJ-3、HJ-1 发 酵 提 取 物 的IC50分 别 为 126.64、118.56、221.34 μg/mL。

表1 内生真菌次级代谢产物提取物的抗单胺氧化酶活性

2.3 菌株的分子生物学鉴定

菌株SJ-2 气生菌丝棉絮状、茂盛、白色，菌落背面产生淡红色色素，其ITS 序列与 GenBank 中的MK028863.1（Fusarium tricinctum）比 对 相似 度 为98%，因此将内生真菌SJ-2 鉴定为镰孢属（Fusarium）真菌。菌株WJ-3 菌丝有横隔，分生孢子经多次分生产生几轮对称或不对称小梗，其ITS 序列与Gen⁃Bank 中的 MK357511.1（Penicilliumsp.）比对相似度为97%，因此将内生真菌WJ-3 鉴定为青霉菌属（Penicillium）真菌。菌株HJ-1 生长速度较快，菌落为白色、毯状、全缘，基质棕色，将菌株HJ-1 的ITS序列与 GenBank 中的 MH329584.1（Alternaria alter⁃nata）比对，相似度为98%，因此将内生真菌HJ-1鉴定为链格孢属（Alternaria）真菌。

2.4 单体化合物结构鉴定

通过硅胶柱色谱、高效液相色谱等方法从菌株SJ-2 的菌液提取物中分离得到了3 个纯的单体化合物，并通过1H NMR、13C NMR 等波谱解析技术，参考文献［3-5］，鉴定了其结构。

2.4.1 化合物1 白色粉末，紫外光波长254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇不显色。1H NMR（600 MHz，CD3OD）：δ5.14（3H，d，J=7.9 Hz），4.52（3H，d，J=9.4 Hz），3.12（9H，s），2.37～2.26（6H，m），1.06（9H，d，J=6.6 Hz），0.98（9H，d，J= 6.7 Hz），0.96（9H，d，J=6.8 Hz），0.90（9H，d，J=6.7 Hz）。13C NMR（50 MHz，CDCl3）：18.4（CH3），18.6（CH3），19.3（CH3），20.3（CH3），27.8（CH），29.8（CH），33.0（NCH3），62.9（CH），75.7（CH），169.3（C=O），170.2（C=O）。其1H-NMR、13C-NMR 数据与参考文献［4］报道基本一致，因此该化合物被鉴定为Ennia⁃tin B。

2.4.2 化合物2 白色粉末，紫外光波长254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇显黄色。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ6.61（1H，d，J=2.2Hz，H-4），7.02（1H，d，J=2.2Hz，H-6），3.69（6H，s，7-OCH3和 H-8），6.45（1H，s，H-3’），6.06（1H，s，H-5），2.29（3H，s，H-7），3.37（3H，s，H-9），12.99（1H，s，2-OH）。其1H-NMR 数据与参考文献［5］报道一致，因此该化合物被鉴定为Monomethylsulochrin。

2.4.3 化合物3 白色粉末，紫外光波长254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇显黄色。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ7.70（1H，brs，H-1），7.42（1H，d，J=8.2 Hz，H-16），6.85（1H，d，J=2.3 H z，H-19），6.80（1H，dd，J=8.2，2.3 Hz，H-17），5.97（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），4.90（1H，d，J=9.5 Hz，H-21），4.17（1H，dd，J=11.0 Hz，5.0 Hz，H-12），4.10（1H，dd，J=9.5、7.5 Hz，H-6），3.82（3H，s，H-25）3.64（2H，m，H-9），3.50（1H，dd，J=15.8、5.0 Hz，H-13a），3.09（1H，dd，J=15.8、11.0 Hz，H-13b），2.40（1H，m，H-7a），2.22（1H，m，H-7b），2.05（1H，m，H-8a），1.92（1H，m，H-8b），1.99（3H，s，H-24），1.64（3H，s，H-23）。其1H-NMR 数据与参考文献［6］报道一致，因此该化合物被鉴定为Fumitremorgin C。

3 讨论

在试验中分离内生菌所用的植物都是新鲜植物，试验前用纯净水清洗 4～5 次，然后用75% 乙醇和1% 的升汞表面消毒，最后用无菌水洗涤，洗涤后的无菌水进行涂板培养，结果无杂菌长出，证明消毒比较彻底［6］。

目前，人们对植物内生真菌活性的研究主要集中在抗菌、抗肿瘤方面。如李冬利等［7］在药用植物白木香（Aquilaria sineusis）中分离得到19 株内生真菌，用MTT 法测定它们的提取物对人神经胶质瘤细胞SF-268 的细胞毒活性，结果表明，其中抑制率90% 以上的菌株有 6 株。Jouda 等［8］在藤黄（Garcin⁃ia nobilis）的叶中分离得到一株青霉属真菌，它的次级代谢产物对枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌表现出较强的抑制活性。但截至目前，关于内生真菌提取物的抗MAO 活性的报道较少。本试验对分离自4 种药用植物的20 株内生真菌的发酵产物的抗单胺氧化酶活性进行了研究，筛选出3 种具有活性的菌株。通过分子生物学方法鉴定它们为镰孢属、青霉菌属和链格孢属真菌。镰孢属为丝孢纲瘤座菌目真菌，该属真菌具有抗菌等活性［9］。青霉菌属为子囊菌亚门不整囊菌纲散囊菌目散囊菌科真菌，该属真菌能代谢出多种抗肿瘤、抗菌等活性的化合物［10］。链格孢属是全球分布最广的半知菌类真菌之一，是一种有应用潜力的生物资源，该属真菌能代谢出具有抗肿瘤、抗菌活性的化合物［11，12］。截至目前，未见关于上述3 属真菌抗单胺氧化酶活性的报道。本试验进一步对筛选出的活性菌株 SJ-2（Fusarium tricinctum）的化学成分进行了初探，得到了3 个化合物，分别为 Enniatin B（化合物 1）、Monomethylsulo⁃chrin（化合物 2）、Fumitremorgin C（化合物 3）。据报道，Enniatin B 为一种细胞毒素，能够诱导细胞凋亡，还能够增加脂多糖（LPS）引发的细胞中白细胞介素-1β（IL-1β）的释放［13］。张弘弛等［14］发现 Mono⁃methylsulochrin 具有抑制拟青霉属（Penicilliopsis）、粉孢霉属（Oidium）、曲霉属（Aspergillus）、丝核菌属（Rhizoctonia）等真菌的作用。Fumitremorgin C 是一种霉菌毒素，还是乳腺癌抗性蛋白（ABCG2/BCRP）的抑制剂，可逆转与癌细胞相关的细胞耐药性［15］。