高效液相色谱法测定度鲁特韦的手性杂质

孙宝丹，周灵祺，柳宏巧，王忠美，李翔，王世辉*（.宁波诺柏医药有限公司，浙江 宁波 35000；.浙江朗华制药有限公司，浙江 台州 37000）

度鲁特韦是一种人类免疫缺陷病毒类型1 整合酶链转移抑制药，临床上适合与其他抗逆转录病毒药联用，治疗成年、12 岁以上和体质量超过40 kg 儿童的HIV-1 感染[1-3]。药理学研究表明度鲁特韦（4R，12S）构型的抗病毒作用强于其他3个手性构型（化学结构式见图1）[4-6]，因此在度鲁特韦质量控制方面，有效控制其他3 个手性杂质非常有必要，但国内目前尚未见关于手性检测这方面的报道。本研究建立了度鲁特韦手性杂质的高效液相色谱检测方法，可作为度鲁特韦原料药和制剂手性纯度的评价方法。

图1 度鲁特韦及手性杂质A、B、C 的化学结构Fig 1 Structure of dolutegravir and chiral impurities A，B and C

1 仪器与试药

高效液相色谱HPLC（安捷伦1200，配备DAD 检测器，Chemstation 数据处理系统）；XS205分析天平（十万分之一，瑞士Mettler Toledo 公司），度鲁特韦供试品（原料药批号：1910001、1910002、1910003； 片剂批号：W66M；Glaxo Opearations UK Ltd），度鲁特韦（批号：RS-1909001，含量：99.9%）、手性杂质A（批号：RSCIMPA-1909001，含量：99.2%）、手性杂质B（批号：RS-CIMPB-1909001，含量：92.0%）、手性杂质C（批号：RS-CIMPC-1909001，含量：91.2%）对照品（浙江朗华制药有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，Honeywell）；超纯水；磷酸色谱级（阿拉丁）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DAICEL OJ-RH（150 mm×4.6 mm，5.0 µm）；流速：0.4 mL·min－1；柱温：40℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；以0.2%磷酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，乙腈为流动相C，梯度洗脱程序见表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 溶剂 流动相A∶流动相B ＝1∶1（V/V）。

2.2.2 供试品溶液 称取度鲁特韦供试品25 mg置于50 mL 量瓶中，用溶剂超声溶解并定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

表1 梯度洗脱程序表(%)Tab 1 Gradient elution programme (%)

2.2.3 0.20%对照溶液 称取度鲁特韦对照品25 mg，置于50 mL 量瓶中，用溶剂超声溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密移取对照品溶液0.2 mL，置于100 mL 量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为0.20%对照溶液。

2.2.4 混合手性杂质对照品溶液 称取对照品度鲁特韦25 mg、手性杂质A 25 mg、手性杂质B 25 mg 和手性杂质C 21 mg 置于100 mL 量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，移取上述溶液5 mL 置于25 mL 量瓶中，加入溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合手性杂质对照品储备液。移取上述混合手性杂质对照品储备液1.5 mL 置于100 mL 量瓶中，加入溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合手性杂质对照品溶液。

2.2.5 混合对照品溶液 称取度鲁特韦对照品25.0 mg，置于50 mL 量瓶中，用“2.2.4”项下混合手性杂质对照品溶液溶解至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 分别量取“2.2”项下的溶剂、供试品溶液、混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果度鲁特韦保留时间约为18 min，理论板数按度鲁特韦峰计为6370，与相邻手性杂质峰分离度为2.5，拖尾因子1.17，符合要求（见图2）。

图2 度鲁特韦手性检测系统适用性图谱Fig 2 Chromatograms of system suitability test for dolutegracir

2.3.2 定量限和检测限 取“2.2.4”项下混合手性杂质对照品溶液进行逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件进样分析。当信噪比（S/N）为3∶1 时，测得度鲁特韦和手性杂质A、B、C 的检测限分别为25、25、27、30 ng·mL－1；当信噪比（S/N）为10∶1 时，测得度鲁特韦和手性杂质A、B、C 的定量限分别为83、83、89、100 ng·mL－1。

2.3.3 仪器精密度 取“2.2”项下系统适用性溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果度鲁特韦及手性杂质A、B 和C 的RSD分别为0.00%、0.20%、0.89%和1.1%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性 按照“2.2.5”项下混合对照品溶液配制方法，平行配制6 份溶液，由同一分析人员进样分析，测定其手性纯度。结果度鲁特韦峰和手性杂质A、B、C 的RSD分别为0.00%、1.9%、2.7%和1.6%，结果表明方法重复性良好。

2.3.5 中间精密度 在不同时间，使用不同仪器，由不同分析人员按照“2.2.5”项下混合对照品溶液的配制方法，平行配制6 份溶液，按“2.1”项下色谱条件测定其手性纯度，结果度鲁特韦、手性杂质A、B 和C 的RSD结果分别为0.00%、2.6%、5.0%和2.9%（n＝2），结果表明中间精密度良好。

2.3.6 溶液稳定性 取“2.2.2”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件每隔2 h 进样分析，结果度鲁特韦和手性杂质C 在48 h 内RSD分别为0.40%和0.00%；手性杂质A 和B 在48 h 内均未检出，结果表明供试品溶液在48 h 内是稳定的。

2.3.7 线性关系考察 分别移取“2.2.4”项下混合手性杂质对照品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和5.0 mL 置100 mL 量瓶中，加入溶剂稀释至刻度，配制成线性溶液；分别进样上述线性溶液，记录色谱峰面积。以度鲁特韦和各手性杂质的峰面积（A）对质量浓度（C）进行线性回归，按照标准曲线法（杂质斜率除以主成分斜率），计算各杂质与主成分的校正因子，结果见表2，度鲁特韦和手性杂质A、B、C 在对应线性范围内与峰面积线性关系良好。

表2 线性结果表Tab 2 Linearity

2.3.8 准确度 准确称取1910001 批次度鲁特韦供试品共9 份，每个准确度水平配制3 份杂质加样溶液，进样测定。各杂质在0.05%、0.15%和0.25%水平进行加样配制。手性杂质A、B、C 平均加样回收率均在81.38%～100.7%，RSD均在0.33%～4.2%，准确度良好。

2.3.9 耐用性 取“2.2”项下的系统适用性溶液，分别在流速变化（±0.05 mL·min－1）、色谱柱温度变化（±5℃）、检测波长变化（±2 nm）、磷酸浓度变化（±0.05%）等色谱条件下进行测定，测得系统适用性均满足要求，表明在其他条件不变的情况下，流速、柱温和波长的微小变化对度鲁特韦与手性杂质的分离均无明显影响，说明该方法耐用性较好。

2.3.10 供试品手性杂质检测 依法对1 批片剂和3批原料药供试品进行手性杂质检测，结果见表3。

表3 度鲁特韦批含量检测结果表Tab 3 Content determination of dolutegravir

3 讨论

3.1 波长的选择

对手性杂质混合溶液储备液在200 ～400 nm波长范围内进行紫外最大吸收扫描，发现度鲁特韦和其手性杂质的最大吸收波长均为254 nm，因此选择254 nm 作为检测波长。

3.2 色谱柱的选择

考察了IC、AD-3R 和OJ-RH 3 种手性色谱柱对度鲁特韦和手性杂质分离的情况。IC 柱：度鲁特韦峰拖尾严重，与手性杂质无法分离；AD-3R 柱：度鲁特韦与杂质A 和B 分离较好，但与杂质C 分离选择性差，调整洗脱程序，改善不大；OJ-RH 柱：对度鲁特韦和手性杂质A、B 和C 都有较好的选择性，因此最终选择OJ-RH 作为检测色谱柱。

3.3 流动相的选择

度鲁特韦和手性杂质A、B 和C 都是钠盐，易溶于酸性溶液，因此选择磷酸水溶液作为水相；考察了乙腈、甲醇、异丙醇作为有机相时度鲁特韦和各手性杂质分离的情况，手性选择性：乙腈＜甲醇≈异丙醇，但是甲醇和异丙醇洗脱能力较弱，尤其是异丙醇，即使占流动相比例高达75%，度鲁特韦的出峰时间仍然很晚，峰展宽非常严重，因此最终将甲醇和乙腈相结合作为有机相，这样既满足分离要求，又能提高洗脱能力。

综上所述，本文所建立的高效液相色谱法可以准确测定度鲁特韦的手性杂质，方法学研究表明该方法准确度高、重复性好、专属性强，且能为度鲁特韦原料药甚至是制剂的手性杂质标准的建立提供技术支持。