野生与栽培夏枯草不同生长期3种酚酸成分含量动态研究

皮胜玲，郭小兰，刘密，李伟，刘湘*（.湘潭市中心医院药学部，湖南 湘潭 400；2.湖南中医药大学药学院，长沙 40208）

夏枯草Prunella vulgarisL.为唇形科夏枯草属多年生草本植物，以干燥果穗入药，为我国常用中药材，自1963年版《中国药典》起，中国历届药典都收载了夏枯草[1]。夏枯草常用于治疗目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈、乳癖、乳房胀痛等，现代研究表明夏枯草中主要的活性成分为三萜及其苷、酚酸、黄酮及多糖类，其中的酚酸类具有抗病毒、抗氧化及抗肿瘤等生物活性[2]。

夏枯草作为药食两用中药，近几年被广泛用于“王老吉”“加多宝”等多种凉茶的制作生产，以夏枯草为原料的中成药及保健产品也如雨后春笋般层出不穷。以往夏枯草主要以野生品种供应市场，而近年来国内外对夏枯草的需求量越来越大，夏枯草人工规范化栽培已成为趋势[3-4]。目前《中国药典》收载的入药部位为果穗，而经考证，夏枯草药用部位经历了带穗全草、果穗及带穗全草、单用半枯或成熟果穗3 个时期[5]。也有研究表明，夏枯草果穗的最佳采收期在6月下旬，茎叶的最佳采收期为5月底，叶中的活性成分含量接近果穗中活性成分的含量，认为夏枯草全草具一定的入药价值[6]。本试验通过测定野生与栽培夏枯草全草不同生长发育期的指纹图谱及3 种酚酸成分的含量，为确定夏枯草全草的最佳采收期及全草的药用价值提供参考依据。

1 材料

1.1 样品及其来源

供试野生与栽培夏枯草全草共20 份，由湖南中医药大学王智副教授鉴定为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarisL.的全草，试验设在湖南中医药大学药植园夏枯草种植基地，地理坐标为E 112°54'，N 28°08'，海拔88 m。试验地土壤为砂质黄壤土，肥力中等。2017年3月在3 块试验地上播种，夏枯草种子由湖南中医药大学王智副教授提供，播种前施入有机复合肥作为底肥一次性施入土壤。于2018年3月—6月在夏枯草种植基地设置采样区，每次随机采集栽培夏枯草植株5 ～20 株（含根），同时采集原本生长在药植园其他区域的野生夏枯草植株（含根），并在夏枯草生长期间观察植株生育期进程并记录。栽培夏枯草3—4月份每间隔约15 d 采集一次，进入成熟期后间隔约7 d 或3 d 采集一次，因野生夏枯草数量有限，从5月份开始采集，栽培样品共采集11 次，野生样品共采集9 次。全草样品于阳光下晒干，粉碎混匀后过筛（40 目），编号装袋保存。材料信息如表1所示。

1.2 仪器与试药

Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪（沃特世公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；万分之一CP114 型电子分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；101 型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗器械厂）；电热恒温水浴锅（北京国华医疗器械厂）；0.22 μm 微孔滤膜（上海安谱试验科技股份有限公司）。

表1 野生与栽培夏枯草全草供试样品Tab 1 Samples of wild and cultivated Prunella vulgaris L.

迷迭香酸（批号：140318，纯度＞98%）、咖啡酸（批号：140107，纯度＞98%）（四川维克奇公司），异迷迭香酸苷（课题组自制，经HPLC 检测，纯度＞98%），乙醇、甲醇均为分析纯，乙腈和甲醇为色谱纯，试验用水均为超纯水（18.25 MΩ·cm）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 ACQUITYUPLC@BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温30℃，流速0.3 mL·min－1，进样量1 μL，波长280 nm，流动相为A 为甲醇，B 为0.1%甲酸水，梯度洗脱，具体洗脱程序如表2，色谱图见图1。

表2 UPLC 梯度洗脱Tab 2 UPLC gradient elution

2.2 供试品溶液的制备

精密称取夏枯草药材粗粉约0.1 g，加入20 mL 70%甲醇提取溶剂，水浴回流提取30 min，冷却称重，70%甲醇补足重量，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.3 对照品储备液的制备

图1 混合对照品（A）和夏枯草样品（B，Z8）的UPLC 图Fig 1 UPLC chromatogram of mixed control（A）and Prunella vulgaris L.samples（B，Z8）

分别精密称取对照品异迷迭香酸苷0.0021 g，迷迭香酸0.0022 g 和咖啡酸0.0024 g，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，配制成含异迷迭香酸苷0.21 mg·mL－1、迷迭香酸0.22 mg·mL－1和咖啡酸0.24 mg·mL－1的混合对照品储备液。

2.4 野生与栽培夏枯草药材3 种酚酸成分测定

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.3”项下对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL 置于5 mL 量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，得到不同浓度对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到标准曲线方程及线性范围，见表3。

表3 3 种成分线性方程Tab 3 Linear equations of 3 components

2.4.2 精密度试验 取同一份夏枯草供试品溶液（Z8）连续进样6 次，结果咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸3 种成分的峰面积RSD分别为0.32%、1.1%和1.3%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一份夏枯草供试品溶液（Z8），分别于样品制备后的0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，测定峰面积，计算RSD。结果溶液中咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸3 种成分峰面积RSD分别为1.7%、2.1%和1.5%。表明24 h 内供试品溶液稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 称取Z8 药材约0.1 g 共6 份，精密称定，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸的峰面积RSD分别为2.0%、2.7%和2.2%，表明该方法的重复性良好。

2.4.5 加样回收试验 取已知含量的夏枯草药材（Z11）粉末约0.1 g，精密称定，平行6 份，分别加入0.5 mL 的同一对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定含量并计算各成分的加样回收率。结果表明咖啡酸、异迷迭香酸苷和迷迭香酸3 种成分的加样回收率均值分别为99.6%、100.2%、99.4%，RSD分别为1.6%、1.2%、1.3%，表明该方法的准确度良好。

2.4.6 样品测定 精密称取20 份夏枯草样品，分别将11 批栽培品和9 批野生品按“2.2”项下方法制备供试品溶液并测定，结果见表4。

表4 野生与栽培夏枯草全草不同生长期中3 种成分的含量Tab 4 Contents of 3 components in wild and cultivated Prunella vulgaris L.in different growth stages

2.5 野生与栽培夏枯草UPLC 图谱的建立

选取栽培样品Z1 为参照图谱，导入20 批样品UPLC 数据及图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 版）软件进行处理，建立具有18 个峰的野生与栽培不同生长期的UPLC共有模式（见图2），通过与对照品进行对照，确定4 号峰为咖啡酸，9 号峰为异迷迭香酸苷，10号峰为迷迭香酸。

图2 野生与栽培夏枯草全草不同生长期对照图谱Fig 2 Reference fingerprint of wild and cultivated Prunella vulgaris L.in different growth stages

2.6 数据分析

2.6.1 野生与栽培夏枯草不同生长期3 种酚酸成分变化趋势图 将表4的数据分别以各指标性成分的含量为纵坐标，以不同采收月份为横坐标，绘制野生与栽培夏枯草3 种酚酸成分随采收月份变化的趋势图（见图3）。如图所示，栽培和野生夏枯草中3 种酚酸成分含量随月份变化的趋势大致相同，其中异迷迭香酸苷、迷迭香酸含量从3月到6月逐月累积，到6月10日最高，之后逐渐下降。

图3 栽培（A）和野生（B）夏枯草全草不同生长期3 种成分含量变化趋势图Fig 3 Variation of the contents of 3 components in cultivated（A）and wild（B）Prunella vulgaris L.in different growth stages

2.6.2 两样本独立t检验 采用SPSS 21.0 软件对同一时期的野生与栽培夏枯草样本的数据进行独立样本t检验，通过分析得到3 种成分均具有方差齐性（P＞0.05）的特点。但对同一生长时期的野生与栽培夏枯草而言，3 种成分的含量在野生品与栽培品之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6.3 聚类分析 以20 批夏枯草样品中18 个共有峰的峰面积为变量，采用SPSS 21.0 软件对样本进行聚类分析（见图4）。以欧式距离为测度，采用Ward 法对数据进行标准化处理，结果样品被聚成单独两类，a 类为不同生长期的野生夏枯草样品，b 类为不同生长期的栽培夏枯草样品。

图4 不同生长期野生与栽培夏枯草系统聚类图Fig 4 Clustering diagram of wild and cultivated Prunella vulgaris L.in different growth stages

2.6.4 偏最小二乘判别分析 为进一步评价野生与栽培夏枯草不同生长期的成分含量差异，筛选导致样品间差异的化学成分，以18 个共有峰的峰面积为变量，采用SIMCA-P13 软件进行偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和变量投影重要性图（variable importance plot，VIP）分析，建立PLS-DA 的3D 图和VIP 图（见图5）。按PLS-DA的结果对18 个共有峰峰面积的VIP 值大小进行排列，结果显示5、4、10、16 和7 号色谱峰的VIP 值均大于1，表明以上化学成分对不同生长期的野生与栽培夏枯草样品差异性影响较大，其余色谱峰VIP 值小于1，对样品的区分较小。其中4 号峰为咖啡酸，10 号峰为迷迭香酸。

3 讨论

3.1 夏枯草全草的最佳采收时期

图5 夏枯草样品偏最小二乘判别分析3D 图与VIP 图Fig 5 3D and VIP plots of partial least squares discriminant analysis of Prunella vulgaris L.samples

本文研究结果表明，6月10日野生和栽培夏枯草全草中的迷迭香酸和异迷迭香酸苷的含量达到最高水平，咖啡酸含量也处于较高水平，确定6月10日左右为野生与栽培夏枯草全草的最佳采收期。而之前有研究表明夏枯草果穗的采收期在6月下旬为宜，茎叶的采收期为5月底，认为全草的最佳采收期可将果穗和茎叶的最佳采收期进行适宜的折中，本研究佐证了这一推测[6]。6月10日以后3 种成分的含量均呈现下降趋势，且6月10日以后整个植株开始枯萎，考虑所处地区气候，如果下雨植株易倒伏。若过早采收，代谢产物积累不足，活性成分含量不高，如异迷迭香酸苷在3—4月间的积累量不足未达到检测限；若过迟采收，则受到自身代谢和江淮地区梅雨期的影响，使活性成分减少，因此，本文研究认为江淮地区夏枯草全草的最佳采收期为6月中上旬，在果穗半/全枯、植株未枯萎之际。

3.2 野生与栽培夏枯草全草的入药价值

2020年版《中国药典》规定夏枯草果穗迷迭香酸含量不少于0.2%，野生与栽培夏枯草全草的最佳采收期6月10日时的迷迭香酸含量均已达到药典入药标准，野生与栽培夏枯草全草均具一定的入药价值。关于夏枯草的药用部位，古代文献记载与现代临床应用颇不一致，古人用夏枯草有用茎、叶者，也有用花者，而现在全国大多数地区销售和临床所用则以果穗为主导，目前已有研究表明夏枯草茎叶中的活性成分含量接近果穗中活性成分的含量，夏枯草全草的抗肿瘤作用不逊于夏枯草果穗[6-7]。而我国西南地区及东南亚地区仍有使用夏枯草全草的习惯，在欧洲和台湾也多见夏枯草全草使用[2，8]。夏枯草全草入药能提高夏枯草利用率，特别是在自然资源不足时，对于保护夏枯草野生资源、维护生态环境具一定的现实意义。

4 结论

本文确定了夏枯草全草的最佳采收期为6月中上旬，野生与栽培夏枯草全草3 种酚酸成分不同生长期的含量差异不明显，到采收期后两者均具有入药价值。目前国内外对夏枯草的研究较多，主要为单一成分研究，不够深入，其药理作用的研究也主要停留在粗提物，而且关于夏枯草中的单体化合物或某个部位的代谢的研究几乎没有[9-10]。本研究表明，夏枯草3 种酚酸成分随不同采收月份的变化趋势具有一致性，特别是迷迭香酸和异迷迭香酸苷，这提示在植物体内这3 种成分的代谢过程可能具有相关性，需要进一步深入研究。本研究系统地比较了野生与栽培夏枯草不同生长时期化学成分的差异，明确了其变化趋势，为确定夏枯草全草的适宜采收期提供了科学依据，同时也为夏枯草药材质量的综合评价和控制提供可靠的方法。