金属硫蛋白-3与肝细胞肝癌TACE治疗近、远期疗效的关系

吴 军， 闫雪华， 陈小勇， 杨祯忠， 张继续， 张 沅

肝细胞癌（HCC）是全球第二大肿瘤死亡原因，严重危害着人们的生命安全［1］。我国是HCC的高发国家，发病率占全球患者总数的55%左右［2］。HCC是一类血供的恶性肿瘤，约90%以上血供来自于肝动脉［3］。TACE已被公认为是治疗不能切除HCC有效的常用方法之一［4］。目前，临床缺乏准确率高的评价TACE治疗疗效的生物标志物。

金属硫蛋白-3（metallothionein-3，MT-3）是一种分子量为6～7 kD，富含半胱氨酸的蛋白质，有维持体内锌离子稳态和清除自由基的作用［5］。有文献报道MT在HCC组织中低表达，HCC分化程度低者MT表达水平低，其与HCC发病及进展有关［6］。目前有报道证实MT-3可下调神经胶质瘤细胞自噬水平［7］。癌细胞的自噬水平与化疗灵敏度密切相关［8］。推测HCC病灶内MT-3水平可反映癌细胞的自噬水平，检测其水平可了解TACE治疗疗效，遂开展本研究，以期为HCC患者TACE治疗疗效评估提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择2013年3月至2015年1月在兰州市第二人民医院院确诊的104例HCC患者作为研究对象。参照《原发性肝癌规范化诊治专家共识》［9］诊断和治疗HCC。纳入标准：①经穿刺病理检查确诊为HCC；②接受TACE治疗；③有保存在液氮罐中完好的HCC组织；④年龄18～70岁；⑤Child-Pugh分级A级或B级。排除标准：①肿瘤分期Ⅲb期或Ⅳ期；②存在TACE治疗禁忌；③生存期低于3个月；④美国东部协作组（ECOG）体力状况（PS）评分高于2分；⑤接受过射频消融术、微波消融术、根治性手术或靶向药物治疗等。104例HCC患者中男72例，女32例，年龄51～70岁，平均（62.7±5.3）岁。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 临床信息收集 收集HCC患者年龄、性别、肿瘤分期、肿瘤数目、肿瘤直径、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、Child-Pugh分级、甲胎蛋白（AFP）、TACE治疗后近、远期疗效等。

1.2.2 HCC组织中MT-3水平检测 采用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）［10］检 测HCC组织中MT-3水平。步骤如下：将细胞裂解液滴加至装有HCC组织的试管中，裂解癌组织细胞；4℃下以3 500 r/min转速离心10 min（离心半径8 cm），分离上清液；用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量；电泳120 V 100 min，转膜200 mA 90 min；滴加兔抗人MT-3单克隆抗体（上海群己生物科技有限公司），4℃孵育过夜，次日滴加二抗，室温下孵育1 h；曝光显影，用Image J软件分析实验结果。

1.2.3 TACE治疗方法 术前检查所有HCC患者血、尿、粪便常规，凝血功能，肝，肾功能及心电图等。术中患者取仰卧位，常规消毒、铺巾，局部麻醉。经股动脉入路，置入导管鞘，插管至腹腔动脉或肝总动脉造影，了解肿瘤病灶的供血情况。将化疗药物（奥沙利铂100 mg/m2和5-氟尿嘧啶500 mg/m2）和5～20 mL已充分乳化的化疗药物与超液化碘化油混悬液灌注至肿瘤病灶供血动脉［11］。根据肿瘤病灶大小和血供情况判断乳化剂用量，最大程度做到完全栓塞。术后给予镇痛、保肝和止吐药物，同时给予营养支持，密切观察有无相关并发症发生，如发热、恶心、呕吐及肝区闷痛等，如有相关并发症发生给予对症治疗［12］。术后1个月复查CT，若有新生肿瘤病灶或病灶内有强化区域，再次给予TACE治疗；若肿瘤病灶坏死且无增大或碘油沉积浓密，则暂不给予TACE治疗。若发生TACE治疗抵抗，则采取综合治疗方案，如联合靶向治疗、消融治疗等。

1.2.4 TACE治疗疗效判断 于患者出院后1个月开始随访，首次随访采用复诊方式，复查CT或MRI，了解有无肿瘤复发、转移等情况。后续随访通过电话和复诊方式了解HCC患者预后情况。每月随访1次，末次随访时间为2020年1月18日。

近期疗效：采用改良实体瘤疗效评价标准（mRECIST）［13］评价TACE治疗的近期疗效（术后4周）。经CT或MRI检查，所有目标病灶内动脉期无增强显影，则定义为完全缓解（CR）；经CT或MRI检查，目标病灶的直径总和降低30%，则定义为部分缓解（PR）；经CT或MRI检查，目标病灶的直径总和降低，但未达到PR标准或升高程度低于20%，则定义为疾病稳定（SD）；经CT或MRI检查，目标病灶的直径总和升高20%或有新病灶出现，则定义为疾病进展（PD）。本研究将CR、PR和SD定义为治疗有效，将PD定义为治疗无效［14］。

远期疗效：用HCC患者5年生存预后评价TACE治疗的远期疗效。通过电话及复诊等方式了解HCC患者生存及死亡等情况。

1.3 统计学分析

用SPSS 24.0软件进行统计学分析。正态分布的定量资料用均数±标准差（±s）表示，两组独立数据比较采用独立样本t检验。定性资料用例或率（%）表示，组间比较采用χ2检验。用受试者工作特征（ROC）曲线评价MT-3诊断TACE治疗疗效的价值。用Kaplan-Meier绘制不同MT-3水平的HCC患者生存曲线，用Log-Rank法比较差异。用Cox回归分析影响HCC患者生存预后的因素。将P＜0.05定义为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较

104例HCC患 者 经TACE治 疗 后，CR 18例（17.3%），PR 31例（29.8%），SD 21例（20.2%），PD 34例（32.69%）。有效组（70例）和无效组（34例）在年龄、性别、Child-Pugh分级、肿瘤分期、肿瘤数目、肿瘤直径、HBsAg和AFP水平方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 MT-3评价TACE疗效的价值

有效组HCC组织中MT-3水平为（4.29±1.01），高于无效组（3.07±0.68），差异有统计学意义（t=7.275，P＜0.001）。MT-3评 价 接 受TACE治 疗 的HCC患者近期疗效的ROC曲线下面积（AUC）为0.825（95%CI：0.738～0.892），最大约登指数为0.550，其所对应的最佳截断点、灵敏度和特异度分别为3.52、76.5%和78.6%，见图1①。104例HCC患者1年、3年和5年生存率分别为85.6%（89/104）、72.1%（75/104）和59.6%（62/104）。MT-3评价接受TACE治疗的HCC患者远期疗效的ROC AUC为0.913（95%CI：0.842～0.960），最大约登指数为0.720，其所对应的最佳截断点、灵敏度和特异度分别为3.58、88.10%和83.87%，见图1②。

表1 两组患者基线资料比较

图1 MT-3诊断TACE治疗近远期疗效的ROC曲线

2.3 MT-3与接受TACE治疗的HCC患者预后的关系

以MT-3评价接受TACE治疗的HCC患者远期疗效的最佳截断点为界，将104例HCC患者分为两组：高表达组（MT-3≥3.58，n=63）和低表达组（MT-3＜3.58，n=41）。高表达组中位生存时间高于低表达组（60个月比26个月），差异有统计学意义（Log-Rank Chi-square=45.373，P＜0.001），见图2。

2.4 影响接受TACE治疗的HCC患者预后的因素分析

图2两组患者生存曲线

将HCC患者5年生存预后作为因变量，将年龄、性别、Child-Pugh分级、肿瘤分期、肿瘤数目、肿瘤直径、HBsAg、AFP和MT-3水平作为自变量，纳入Cox单因素回归分析，结果显示肿瘤分期、Child-Pugh分级、肿瘤直径和MT-3水平与HCC患者5年生存预后有关（P＜0.05）。将肿瘤分期、Child-Pugh分级、肿瘤直径和MT-3作为自变量，将HCC患者5年生存预后作为因变量，纳入Cox多因素回归分析，结果显示肿瘤分期、Child-Pugh分级和肿瘤直径是HCC患者5年生存预后的独立危险因素（P＜0.05），MT-3是HCC患者5年生存预后的独立保护因素（P＜0.05），见表2。

表2影响HCC患者5年生存预后的因素分析

3 讨论

MT可螯合致癌金属离子和维持氧化还原稳态在正常细胞发挥抑癌作用。MT在部分恶性肿瘤表达上调，与肿瘤恶性程度高度相关，且与放化疗灵敏度有关［15-16］。MT与铂类化疗药物耐药有关，被视为预后不良的标志物［17-18］。MT-3作为MT家族的一员，在不同类型恶性肿瘤中表达水平差异较大，其在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、多形性成胶质细胞瘤和神经胶质瘤中高表达［6，19-24］，但在HCC、胃癌、食管癌和白血病中低表达［6，25-27］，并与患者 预后关系密切。

本研究主要探究HCC组织中MT-3表达水平与TACE治疗近、远期疗效的关系，结果显示有效组HCC组织中MT-3水平高于无效组，该结果提示MT-3可能与TACE治疗近期疗效有关。此外，本研究结果还显示MT-3评价接受TACE治疗的HCC患者近期疗效的ROC曲线AUC、灵敏度和特异度分别为0.825、76.47%和78.57%，该结果表明MT-3对TACE治疗近期疗效的价值较高，灵敏度和特异度尚可；MT-3评价接受TACE治疗的HCC患者远期疗效的ROC曲线AUC、灵敏度和特异度分别为0.913、88.10%和83.87%，该 结 果 表 明MT-3对TACE治疗远期疗效的价值极高，灵敏度和特异度均较高。为进一步分析MT-3与TACE治疗HCC远期预后的价值，本研究比较了MT-3高表达和低表达组5年生存预后，结果显示高表达组中位生存时间高于低表达组，该结果表明HCC组织中MT-3水平可能与HCC患者预后有关。

张长坤等［28］研究表明HCC患者Child-Pugh分级、肿瘤直径和AFP与预后密切相关。刘光华等［11］研究曾证实HCC肿瘤分期、肿瘤数目多发、病灶直径大于5 cm及AFP是其预后不良的独立危险因素。为避免混杂因素影响分析结果，本研究采用Cox单因素和多因素回归分析影响HCC患者5年生存预后的因素，结果显示肿瘤分期、Child-Pugh分级和肿瘤直径是HCC患者5年生存预后的独立危险因素，而AFP和肿瘤数目与预后无关，与上述文献结果存在出入，推测与样本量大小、地域及纳排标准等有关，后续还需开展大样本、多中心研究予以验证。此外，本研究还证实MT-3是HCC患者5年生存预后的独立保护因素，推测MT-3通过下调HCC细胞自噬水平增加对化疗药物的灵敏度，检测HCC组织中MT-3水平可了解癌细胞的自噬水平，进而了解化疗灵敏度，从而评价TACE治疗疗效。

综上所述，HCC组织中MT-3水平高提示接受TACE治疗的近、远期疗效均较好。本研究尚未探究MT-3参与HCC发病及进展的病理生理机制以及其与HCC细胞化疗灵敏度的关系，下一步将开展基础研究进行阐明。