苏中地区猪圆环病毒2 型感染情况及免疫效果调查

2021-03-07颜友荣方向红

现代畜牧兽医 2021年12期

颜友荣，方向红，魏宁，肖宁

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

猪圆环病毒（PCV）自20 世纪70 年代被发现以来，已在全世界广泛传播，对养猪事业造成巨大影响[1]。PCV-2有较强的致病性[2-3]，在我国断奶仔猪多系统衰竭综合征对猪致病性较明显且影响较大[4]。随着国产PCV-2 灭活苗的推广应用，该病发病率呈明显下降趋势，但仍有部分地区有PCV-2感染的报道[5-6]。为了解苏中地区PCV-2感染情况及疫苗免疫效果，本研究对2020 年9～12 月期间收集到的苏中地区15家猪场的363样本进行检测，以期为苏中地区不同规模猪场防控PCV-2提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本采集（见表1）

2020 年9～12 月期间，根据养殖规模在苏中地区选择15 个均免疫接种过PCV-2 灭活苗的猪场，其中大型猪场4个（存栏量≥5 000头）、中型猪场5个（存栏量1 000～5 000头）、小型猪场6 个（存栏量≤1 000 头）。根据猪场实际情况，共采集363份血清样本与363份疑似PCV2病料组织样本，-20 ℃保存。样本具体数量见表1。

表1 苏中地区不同规模猪场样本采集数量Tab.1 Number of samples collected from different pig farm in Central Jiangsu

1.1.2 试剂与耗材

基因组DNA 提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、Taq DNA 聚合酶、6×DNA Loading Dye、10×PCR Buffer、dNTPMix、25 mmol/L MgCl2等，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD18-T 载体，购自上海宝生物工程有限公司；ELISA试剂盒，购自瑞普生物药业有限公司。

1.1.3 试验仪器

普通PCR 仪（Thermo 公司，TCA5020）、荧光定量PCR循环仪（ABI 公司，7500）、分析天平（Sartorius 公司）、全自动样本快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）、台式冷冻微量高速离心机（Thermo 公司，Micro7R）、移液器（Thermo 公司，Finnpipette F）、多功能酶标仪（Molecular Devices公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 荧光定量PCR抗原检测方法

猪病料样本检测采用荧光定量PCR 法，按照病毒DNA 提取试剂盒说明书操作，进行PCR 扩增。参考引物序列文献[7]，利用美国国家生物技术信息中心引物设计软件进行设计，委托苏州金唯智科技有限公司合成PCV2 特异性引物，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物进行纯化。

Pig-GAPDH-F：5'-TCGGAGTGAACGGATTTGGC-3'；Pig-GAPDH-R：5'-TGACAAGCTTCCCGTTCTCC-3'。

荧光定量PCR 反应体系（20 μL）：2X Real time PCR Master Mix（SYBR Green）10 μL、模板1 μL（cDNA 稀释10 倍）、引物MIX（F/R 各为10 μmol/L）2 μL、0.1%DEPC水7 μL。

荧光定量PCR 反应条件：94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；扩增结束取PCR扩增产物电泳，产物大小为1 767 bp。

1.2.2 间接ELISA抗体检测方法[8]

采用间接ELISA 法检测猪血清样本中的PCV2 抗体[9-10]。具体操作分为4 个步骤：向每个ELISA 板孔中加入100 μL 特异性抗原，37 ℃温育1 h，4 ℃保存16 h，洗涤去除未结合的抗原；取100倍稀释血清样本与阳性对照、阴性对照各100 μL，分别加入ELISA板孔中，37 ℃孵育1 h，洗涤并除去游离物；ELISA板的每个孔中再加入100 μL酶标抗体，37 ℃孵育1 h，洗涤并去除未反应的酶标抗体；每孔添加100 μL 底物，15 min 后添加50 μL 终止液，30 min后用微孔板阅读器观察显色结果。通过显色结果定性判断猪血清样本PCV2抗体情况，定量分析抗体数量。

2 结果与分析

2.1 苏中地区猪病料病原学检测结果（见表2、表3）

表2 苏中地区不同规模猪场猪病料病原学检测结果Tab.2 Etiological results of diseased feed from different pig farm in Central Jiangsu

表3 苏中地区不同年龄段猪病料病原学检测结果Tab.3 Etiological results of pig disease feeds of different age in Central Jiangsu

由表2 可知，猪病料样本PCV2 阳性率为10.7%，其中大、中、小型猪场病料PCV2 阳性率分别为4.9%、7.1%、18.8%。

由表3 可知，仔猪、母猪、育肥猪组织病料PCV2 阳性率分别为2.3%、9.4%、16.9%。

2.2 苏中地区猪血清学检测结果（见表4、表5）

表4 苏中地区不同规模猪场血清学检测结果Tab.4 Serological results of pig farms of different sizes in Central Jiangsu

表5 苏中地区不同年龄段猪血清学检测结果Tab.5 Serological results of pigs of different age in Central Jiangsu

由表4 可知，363 份猪血清样本通过间接ELISA 抗体检测，其中328 份PCV2 抗体检测呈阳性，阳性率达到90.4%。大、中、小型猪场PCV2抗体阳性率分别为94.1%、89.6%、88.2%。

由表5 可知，仔猪、母猪、育肥猪血清样本PCV2 抗体阳性率分别为80.0%、92.6%、95.1%，育肥猪PCV2 抗体阳性比例最高，仔猪最低。

3 讨论

结果表明，苏中地区的猪场有少数猪感染PCV2，小型猪场感染阳性率最高，大型猪场感染阳性率最低，这可能与猪场管理规范程度、生物安全防控水平以及疫苗免疫程序有密切关系[11]。一般情况下，无论是否免疫PCV2疫苗，8～10 周龄左右猪体内的PCV2 抗体处于最低值[12]，期间极易感染病毒，因此育肥猪感染率最高比较合理；仔猪感染率最低，可能与获得母猪的母源抗体有一定的关系。通过血清学抗体检测，免疫接种过PCV-2灭活苗的猪抗体阳性率超过农业农村部规定的最低70%免疫合格标准[13]，说明猪群免疫效果较好，但不能区分是感染阳性还是免疫阳性。PCV2 能引起猪群发病或隐性感染，使猪群免疫受到抑制，降低猪群免疫力和疫苗的免疫效果[14]，因此全部接种PCV2 疫苗的猪群抗体阳性率并未达到100%。由本试验结果可知，极少数猪体内PCV2病原与抗体同时存在[15]，疫苗产生的特异性免疫抗体并不能完全消除猪体内的PCV2病原。