单核细胞增生李斯特菌新疆流行株的毒力及耐药性分析

张再超

（昌吉州动物疾病预防控制中心，新疆 昌吉 831100）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是人畜共患传染病李斯特菌病的病原菌，广泛分布于自然界[1]。李斯特菌病发病急，发病率较低，但病死率高，各种年龄、种类的动物以及人类均可感染发病，主要以幼龄动物和妊娠母畜较易感[2]。目前，已证实LM可感染绵羊、山羊、牛、猪、鹿、鸡、兔、鼠、鸭、鹅、鹦鹉、北极狐等40多种动物。LM 可引起牛、绵羊、山羊以及猪等家畜发生脑膜脑炎、流产和急性败血病[3-4]，也可导致禽类败血症和心肌坏死的发生，对我国畜禽养殖业造成较大的经济损失。同时，LM作为一种重要的食源性细菌，能够污染肉、奶、蛋等动物性食品，引起食品中毒，导致孕妇、新生儿及免疫力低下的成年人发病，对人类的健康也构成极大的威胁[5-6]。近年来，李斯特菌病广泛流行于新疆绵羊群，对当地养殖业产生较大的经济损失，通过动物性食品直接威胁人们的身体健康。此外，临床上滥用抗菌药物造成耐药流行株出现，因此，本研究对LM新疆流行株的毒力、致病性和耐药性开展试验，为科学防治李斯特菌病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

绵羊肝脏内分离得到单核细胞增生李斯特菌菌株LM-SB2 和LM-SB5，现由石河子大学人畜共患病实验室保存；试验小鼠购自石河子大学实验动物中心。

1.2 试剂与仪器

试剂：BHK液体和固体培养基购自湖北泰康医疗设备有限公司；乙醇、二甲苯、石蜡、0.5%～1.0%伊红乙醇溶液，均购自新百特化工公司；苏木素染液购自湖北泰康医疗设备有限公司。

仪器：Pico17离心机（Thermo公司）、Pico17培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、KD-2260切片机（金华市科迪仪器设备有限公司）、NE910显微镜（宁波永新光学股份有限公司）。

1.3 药敏纸片

选用环丙沙星、四环素、万古霉素、阿莫西林、阿奇霉素、克拉霉素、氨苄西林、新生霉素、诺氟沙星、头孢唑啉、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、青霉素、氯霉素、链霉素、红霉素共17种药敏纸片，均由杭州天和微生物试剂有限公司生产，生产批号：090413。

1.4 试验方法

1.4.1 LM-SB2和LM-SB5的培养及计数

将LM-SB2 和LM-SB5 接种至BHK 培养基，37 ℃培养24 h，采用平板菌落计数法分别对LM-SB2 和LM-SB5计数，测得LM-SB2 菌液浓度为4.30×109CFU/mL，LM-SB5菌液浓度为1.43×109CFU/mL。

1.4.2 LM-SB2和LM-SB5的LD50测定

LM-SB2和LM-SB5菌液分别3 000 r/min离心5 min，纯化后，再分别以101、100、10-1、10-2、10-3浓度梯度进行稀释。选择66只小白鼠，随机分为11组，每组6只，其中一组为对照组；分别将LM-SB2和LM-SB5各梯度浓度菌液腹腔注射至各组小鼠体内，每只小鼠注射量为0.1 mL，对照组腹腔注射等量的灭菌生理盐水。接种后采取隔离饲养，1 w 内记录小鼠死亡情况与细胞病变效应（CPE）情况，根据小鼠死亡数采用Read-Muench法计算两种菌株的LD50。

1.4.3 LM-SB2和LM-SB5药敏试验

试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐K-B琼脂法进行。挑取普通营养琼脂平板上的LM-SB2 和LMSB5纯培养菌落，悬于3 mL 生理盐水，混匀后与菌液比浊管比浊。以白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5 MCF）相同。接种适量菌液均匀涂板，待平板上水分被琼脂完全吸收后贴纸片，使用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于15 mm，菌接种后15 min 内贴完纸片。将平板反转，37 ℃培养18～24 h后取出，测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，判断标准参照NCCLS 抗微生物药物敏感试验的执行标准（纸片扩散法）[7]。

2 结果与分析

2.1 LM-SB2和LM-SB5的LD50测定结果（见表1、表2）

由表1、表2可知，同剂量的菌液，在不同的稀释度下，造成小鼠的死亡数不同，接种生理盐水的对照组小鼠均未死亡。接种菌株LM-SB2的各组，死亡数与CPE数均随浓度梯度降低而降低，浓度≤10-2时，死亡数与CPE数均为0；接种菌株LM-SB5的各组中，浓度为101时，该组小鼠全部死亡，且全部发生细胞病变。

表1 菌株LM-SB2接种小鼠后死亡、CPE情况Tab.1 Death and CPE situation of mice after inoculation with strain LM-SB2

表2 菌株LM-SB5接种小鼠后死亡、CPE情况Tab.2 Death and CPE situation of mice after inoculation with strain LM-SB5

根据小鼠的死亡数，计算测得菌株LM-SB2 和LMSB5的LD50分别为4.30×108.5CFU和1.43×107.5CFU。

2.2 LM-SB2和LM-SB5的药敏试验结果（见表3）

由表3 可知，LM-SB2 和LM-SB5 对氨苄西林、青霉素、亚胺培南均耐药；对头孢唑啉、四环素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、氯霉素、万古霉素、新生霉素均敏感；对阿莫西林、诺氟沙星均中介。菌株LM-SB2 对环丙沙星敏感、对阿米卡星中介；菌株LM-SB5 对环丙沙星中介、对阿米卡星敏感。

表3 LM-SB2和LM-SB5的药敏试验结果Tab.3 Results of drug susceptibility test of LM-SB2和LM-SB5

3 讨论

李斯特菌病一直是新疆绵羊养殖的潜在威胁。据调查，自1995年，新疆石河子、奎屯、伊犁等地区先后暴发李斯特菌病，造成大批羔羊死亡[8]。经过流行病学调查发现，该病主要发生在较寒冷地区及气温变化较大的春末与秋末。LM 广泛分布于自然界，对低温、紫外线、酸碱等环境因素具有较强的抵抗力，是重要的食源性人畜共患病病原[8-9]。不同地区的LM对动物机体的致病性存在差异，因此开展新疆地区单核细胞增生李斯特菌新疆流行株的毒力进行测定以及耐药性检测分析，对于掌握该病的流行病学以便采取有效防控措施具有重要意义。

LM的致病性与不同流行株的毒力有关[10-11]。本试验采用腹腔注射接种的方法人工感染小鼠，测定两种LM 毒株的毒力。结果表明，不同LM 流行株之间的毒力存在差异，菌株LM-SB5 的毒力是菌株LM-SB2 的30 倍，不同流行株之间的毒力差异也可作为一个实验室诊断要点。

近年来，抗生素广泛应用于畜禽生产，导致各LM菌株表现不同程度的耐药性，给动物性食品的安全性及该病的防治工作造成巨大隐患。国内调查发现，LM 作为常见食源性细菌之一，在生肉、奶酪、鸡蛋及肉制品等动物性食品中均有不同程度的污染，给人们的健康带来了极大的威胁[12]。

通过对新疆单核细胞增生李斯特菌流行株LM-SB2和LM-SB5进行不同种类17种抗生素药敏试验发现，两株LM新疆流行株对大多数β-内酰胺类抗菌药物耐药；对四环素类、大环内酯类、糖肽类、氯霉素类以及新生霉素抗菌药物均敏感；对部分氨基糖苷类抗菌药物敏感；对喹诺酮类耐药性不明显。药敏试验结果表明，同一种LM 流行株对不同种类抗菌药物耐药性存在差异，不同流行株对于同种抗菌药物耐药性也存在差异，如菌株LM-SB2对环丙沙星敏感，对阿米卡星表现中介；菌株LM-SB5 对环丙沙星中介，对阿米卡星敏感。因此，治疗该病可根据当地流行株对抗菌药物的耐药性，针对性地选择适宜的抗菌药物，并注意防止产生交叉耐药性。加强对单核细胞增生李斯特菌耐药性监测力度，合理使用抗菌药物，防止耐药性进一步扩散，已逐渐成为关注的新课题[13-14]。

4 结论

本试验对单核细胞增生李斯特菌新疆流行株的研究发现，不同LM 新疆流行株之间的毒力存在差异。LM 对β-内酰胺类抗菌药物耐药性较强，因此，在畜牧生产当中，合理使用抗生素，优先考虑对LM敏感的抗菌药物。